A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.
A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.
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DOI：
10.1016/j.str.2012.06.009
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发表时间：
2012-08-08
期刊：
影响因子：
5.7
通讯作者：
Gouaux, Eric
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hattori, Motoyuki;Hibbs, Ryan E.;Gouaux, Eric
优化膜蛋白在不同溶液条件下的稳定性是获得高分辨率衍射晶体的关键。评估蛋白质稳定性的传统方法需要大量的材料，因此不适合膜蛋白的中高通量筛选。在这里，我们提出了一种快速有效的基于荧光检测尺寸排除色谱的热稳定性测定（FSEC-TS）。在这种方法中，目标蛋白与绿色荧光蛋白融合。加热后的蛋白质样品，用一组添加剂处理，然后通过FSEC进行分析。FSEC-TS允许人们在不纯化的情况下评估纳克到微克量的目标蛋白在各种条件下的热稳定性。我们将这种方法应用于线虫P2X4受体和秀丽隐杆线虫葡聚糖来筛选配体、离子和脂质，包括新设计的胆固醇衍生物。在葡萄糖的情况下，筛选结果用于在脂质存在下获得受体的晶体。
Optimization of membrane protein stability under different solution conditions is essential for obtaining crystals that diffract to high resolution. Traditional methods that evaluate protein stability require large amounts of material, and are therefore ill-suited for medium- to high-throughput screening of membrane proteins. Here we present a rapid and efficient fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay (FSEC-TS). In this method, the target protein is fused to GFP. Heated protein samples, treated with a panel of additives, are then analyzed by FSEC. FSEC-TS allows one to evaluate the thermostability of nanogram to microgram amounts of the target protein under a variety of conditions without purification. We applied this method to the Danio rerio P2X4 receptor and Caenorhabditis elegans GluCl to screen ligands, ions and lipids, including newly designed cholesterol derivatives. In the case of GluCl, the screening results were used to obtain crystals of the receptor in the presence of lipids.
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作者：
CULLY, DF;VASSILATIS, DK;ARENA, JP
通讯作者：
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Rasmussen, Soren G. F.;Choi, Hee-Jung;Fung, Juan Jose;Pardon, Els;Casarosa, Paola;Chae, Pil Seok;DeVree, Brian T.;Rosenbaum, Daniel M.;Thian, Foon Sun;Kobilka, Tong Sun;Schnapp, Andreas;Konetzki, Ingo;Sunahara, Roger K.;Gellman, Samuel H.;Pautsch, Alexander;Steyaert, Jan;Weis, William I.;Kobilka, Brian K.
通讯作者：
Kobilka, Brian K.
DOI：
10.1016/0006-291x(81)91599-0
发表时间：
1981-01-01
影响因子：
3.1
作者：
BOKMAN, SH;WARD, WW
通讯作者：
WARD, WW