Studying calcium-triggered vesicle fusion in a single vesicle-vesicle content and lipid-mixing system.
Studying calcium-triggered vesicle fusion in a single vesicle-vesicle content and lipid-mixing system.
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DOI：
10.1038/nprot.2012.134
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发表时间：
2013-01
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
该方案描述了用于研究 Ca2+ 触发的囊泡融合的单个囊泡-囊泡显微镜系统。供体囊泡含有重建的突触短蛋白和突触结合蛋白-1。受体囊泡含有重构的突触蛋白和 SNAP-25，并束缚在 PEG 涂层的玻璃表面上。将供体囊泡与束缚的受体囊泡混合，并在零 Ca2+ 浓度下孵育几分钟，从而产生单个相互作用囊泡对的集合。供体囊泡还含有两种光谱不同的荧光团，可以同时监测内容物和膜的时间变化。因此，在将 Ca2+ 注入样品室时，我们的系统可以区分相互作用的囊泡对的半融合和完全融合，并在亚百毫秒的时间尺度上确定这些事件的时间顺序。其他因子，例如络合素，可以轻松添加。我们的系统是独一无二的，它同时监测含量和脂质混合，并在 Ca2+ 注射之前从相互作用的囊泡对的亚稳态开始。
This Protocol describes a single vesicle-vesicle microscopy system to study Ca2+-triggered vesicle fusion. Donor vesicles contain reconstituted synaptobrevin and synaptotagmin-1. Acceptor vesicles contain reconstituted syntaxin and SNAP-25, and are tethered to a PEG-coated glass surface. Donor vesicles are mixed with the tethered acceptor vesicles and incubated for several minutes at zero Ca2+-concentration, resulting in a collection of single interacting vesicle pairs. The donor vesicles also contain two spectrally distinct fluorophores that allow simultaneous monitoring of temporal changes of the content and membrane. Upon Ca2+-injection into the sample chamber, our system therefore differentiates between hemifusion and complete fusion of interacting vesicle pairs and determines the temporal sequence of these events on a sub-hundred millisecond timescale. Other factors, such as complexin, can be easily added. Our system is unique by monitoring both content and lipid mixing, and by starting from a metastable state of interacting vesicle pairs prior to Ca2+-injection.
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影响因子：
14.8
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
64.8
作者：
SOLLNER, T;WHITEHART, SW;ROTHMAN, JE
通讯作者：
ROTHMAN, JE
DOI：
10.1126/science.1221976
发表时间：
2012-06-22
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Hernandez JM;Stein A;Behrmann E;Riedel D;Cypionka A;Farsi Z;Walla PJ;Raunser S;Jahn R
通讯作者：
Jahn R
DOI：
10.1073/pnas.0906677106
发表时间：
2009-11-03
影响因子：
11.1
作者：
Cypionka, Anna;Stein, Alexander;Walla, Peter J.
通讯作者：
Walla, Peter J.
影响因子：
64.8
作者：
Pertsinidis, Alexandros;Zhang, Yunxiang;Chu, Steven
通讯作者：
Chu, Steven