Optimization of genome engineering approaches with the CRISPR/Cas9 system.
Optimization of genome engineering approaches with the CRISPR/Cas9 system.
复制标题
DOI：
10.1371/journal.pone.0105779
复制
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Pu WT
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Li K;Wang G;Andersen T;Zhou P;Pu WT
诸如TALENS和Cas9之类的设计核酸酶为无痕编辑哺乳动物基因组开辟了新的机遇。在此，我们探究了影响Cas9介导的小鼠胚胎干细胞无痕基因组编辑效率的若干参数。转染条件的优化以及对转染细胞的富集对于高效回收修饰克隆至关重要。成对的向导RNA（gRNAs）和野生型Cas9可高效产生程序性缺失，这有助于靶向克隆的鉴定，而成对的gRNAs和Cas9D10A切口酶则产生较小的靶向插入缺失，且脱靶诱变的几率较低。基因组编辑对于在靶位点程序性引入外源DNA序列也是有用的。增加同源定向修复模板的同源臂长度可显著提高靶向效率，而增加DNA插入片段的长度则会降低靶向效率。总之，我们的数据为使用Cas9核酸酶进行无痕基因敲除、修饰或敲入实验的优化设计提供了指导。
Designer nucleases such as TALENS and Cas9 have opened new opportunities to scarlessly edit the mammalian genome. Here we explored several parameters that influence Cas9-mediated scarless genome editing efficiency in murine embryonic stem cells. Optimization of transfection conditions and enriching for transfected cells are critical for efficiently recovering modified clones. Paired gRNAs and wild-type Cas9 efficiently create programmed deletions, which facilitate identification of targeted clones, while paired gRNAs and the Cas9D10A nickase generated smaller targeted indels with lower chance of off-target mutagenesis. Genome editing is also useful for programmed introduction of exogenous DNA sequences at a target locus. Increasing the length of the homology arms of the homology-directed repair template strongly enhanced targeting efficiency, while increasing the length of the DNA insert reduced it. Together our data provide guidance on optimal design of scarless gene knockout, modification, or knock-in experiments using Cas9 nuclease.
登录
查看更多内容
DOI：
10.1073/pnas.1332608100
发表时间：
2003-06-24
影响因子：
11.1
作者：
de Boer, E;Rodriguez, P;Strouboulis, J
通讯作者：
Strouboulis, J
影响因子：
48
作者：
Gibson, Daniel G.;Young, Lei;Smith, Hamilton O.
通讯作者：
Smith, Hamilton O.
影响因子：
64.8
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
46.9
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
46.9
作者：
通讯作者：
--