Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0075296
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发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Huggett JF
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Sanders R;Mason DJ;Foy CA;Huggett JF
详细描述 mRNA 数量的基因表达测量广泛应用于分子生物学，并且在诊断领域日益重要。生成互补 DNA 所必需的逆转录 (RT) 可能效率低下且不精确，但仍然是使用 qPCR 的典型 RNA 分析工具。本研究开发了一种转录组校准材料，并使用数字 (d)PCR 评估 RT 反应进行 RNA 测量。虽然许多研究都描述了 dPCR 的 DNA 定量能力，但使用 RT-dPCR 进行 RNA 分析来研究类似参数的工作却较少。在测量内源性和合成 RNA 时，使用单一和多重格式对使用三种一步式 RT-qPCR 试剂盒进行的 RT-dPCR 测量进行了评估。将性能最佳的试剂盒与 UV 定量进行比较，并研究灵敏度和技术再现性。我们的结果表明，与 UV 定量相比，依赖于检测和试剂盒的 RT-dPCR 测量结果存在显着差异。尽管使用相同的仪器评估相同的样品，但不同的试剂盒针对每个目标报告了不同的值。 RT-dPCR 没有表现出先前在分析 DNA 时描述的强测定间一致性。这项研究表明，与 DNA 测量一样，RT-dPCR 能够准确定量低拷贝 RNA 靶标，但结果取决于试剂盒和靶标，支持校准控制的需要。
Gene expression measurements detailing mRNA quantities are widely employed in molecular biology and are increasingly important in diagnostic fields. Reverse transcription (RT), necessary for generating complementary DNA, can be both inefficient and imprecise, but remains a quintessential RNA analysis tool using qPCR. This study developed a Transcriptomic Calibration Material and assessed the RT reaction using digital (d)PCR for RNA measurement. While many studies characterise dPCR capabilities for DNA quantification, less work has been performed investigating similar parameters using RT-dPCR for RNA analysis. RT-dPCR measurement using three, one-step RT-qPCR kits was evaluated using single and multiplex formats when measuring endogenous and synthetic RNAs. The best performing kit was compared to UV quantification and sensitivity and technical reproducibility investigated. Our results demonstrate assay and kit dependent RT-dPCR measurements differed significantly compared to UV quantification. Different values were reported by different kits for each target, despite evaluation of identical samples using the same instrument. RT-dPCR did not display the strong inter-assay agreement previously described when analysing DNA. This study demonstrates that, as with DNA measurement, RT-dPCR is capable of accurate quantification of low copy RNA targets, but the results are both kit and target dependent supporting the need for calibration controls.
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