The first five seconds in the life of a clathrin-coated pit.
The first five seconds in the life of a clathrin-coated pit.
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涂有网状蛋白涂层坑的前五秒钟。
DOI：
10.1016/j.cell.2012.05.047
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发表时间：
2012-08-03
期刊：
影响因子：
64.5
通讯作者：
Kirchhausen T
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Cocucci E;Aguet F;Boulant S;Kirchhausen T
包覆的凹坑通过网格蛋白晶格的生长组装起来，通过接头连接到下面的膜。这个过程是如何开始的？我们使用具有单分子EGFP灵敏度和高时间分辨率的活细胞TIRF成像来检测网格蛋白三丝状体和AP2接头的到来，这些接头会启动外壳组装。无偏目标识别和轨迹跟踪，与统计模型一起，产生单个蛋白质的到达时间和数量，以及实验证实的内源性被表达的荧光标记蛋白质替代程度的估计。凹坑由网格蛋白和AP2协调到达而开始，通常以两个连续的步骤检测，每一个三轴体有两个接头。pi -4,5- p2对于起始是必需的。辅助蛋白FCHo1/2则不是；相反，它们是持续增长所必需的。涂层坑起始的客观图像也表明，这里概述的方法将广泛适用于活细胞中动态组装的研究。
Coated pits assemble by growth of a clathrin lattice, linked by adaptors to the underlying membrane. How does this process start? We used live-cell TIRF imaging, with single-molecule EGFP sensitivity and high temporal resolution, to detect arrival of the clathrin triskelions and AP2 adaptors that initiate coat assembly. Unbiased object identification and trajectory tracking, together with a statistical model, yield the arrival times and numbers of individual proteins, as well as experimentally confirmed estimates of the extent of substitution of endogenous by expressed, fluorescently tagged proteins. Pits initiate by coordinated arrival of clathrin and AP2, usually detected as two sequential steps, each of one triskelion with two adaptors. PI-4,5-P2 is essential for initiation. The accessory proteins FCHo1/2 are not; instead, they are required for sustained growth. This objective picture of coated-pit initiation also shows that methods outlined here will be broadly useful for studies of dynamic assemblies in living cells.
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