Reference genes for quantitative Arabidopsis single molecule RNA fluorescence in situ hybridization.
Reference genes for quantitative Arabidopsis single molecule RNA fluorescence in situ hybridization.
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DOI：
10.1093/jxb/erac521
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发表时间：
2023-04-09
影响因子：
6.9
通讯作者：
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
亚细胞mRNA的数量和空间分布是驱动基因调控程序的基础。单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）使用荧光探针标记单个mRNA分子，从而促进定位和定量研究。经验证的参比mRNA用作阳性对照，需要用于校准。在这里，我们提出了第一套拟南芥smFISH参考基因的选择标准。在序列和转录数据评估之后，选择四个mRNA探针组用于成像。计算每个细胞的转录本计数、与细胞大小的相关性和校正的荧光强度以进行比较。除了验证参考探针组，我们提出了样品制备步骤，可以保留绿色荧光蛋白的荧光，从而提供了一种方法，同时RNA和蛋白质检测。总之，我们的参考基因分析，修改后的协议，简化的定量方法一起提供了一个坚实的基础，为未来的定量单分子RNA在拟南芥根尖分生组织细胞的研究。一个修改后的协议，用于验证参考基因适用于定量单分子RNA荧光原位杂交研究在拟南芥根尖分生组织细胞。
Subcellular mRNA quantities and spatial distributions are fundamental for driving gene regulatory programmes. Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) uses fluorescent probes to label individual mRNA molecules, thereby facilitating both localization and quantitative studies. Validated reference mRNAs function as positive controls and are required for calibration. Here we present selection criteria for the first set of Arabidopsis smFISH reference genes. Following sequence and transcript data assessments, four mRNA probe sets were selected for imaging. Transcript counts per cell, correlations with cell size, and corrected fluorescence intensities were all calculated for comparison. In addition to validating reference probe sets, we present sample preparation steps that can retain green fluorescent protein fluorescence, thereby providing a method for simultaneous RNA and protein detection. In summary, our reference gene analyses, modified protocol, and simplified quantification method together provide a firm foundation for future quantitative single molecule RNA studies in Arabidopsis root apical meristem cells. A modified protocol used to validate reference genes suitable for quantitative single molecule RNA fluorescence in situhybridization studies in Arabidopsis root apical meristem cells.
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Birnbaum KD
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