Tools for retargeting proteins within Aspergillus nidulans.
Tools for retargeting proteins within Aspergillus nidulans.
复制标题
DOI：
10.1371/journal.pone.0189077
复制
发表时间：
2017
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Osmani SA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Suresh S;Abdurehman L;Osmani AH;Osmani SA
使用绿色荧光蛋白 (GFP) 内源标记蛋白质，可以使用活细胞显微镜观察标记蛋白质。 GFP 标签广泛用于研究模型实验生物体的生物过程，包括构巢曲霉等丝状真菌。因此，许多构巢曲霉菌株都含有内源性 GFP 标记的不同蛋白质。为了进一步增强基于 GFP 标记的实验方法，我们针对构巢曲霉改造了 GFP 结合蛋白 (GBP) 系统。 GBP 是一种针对 GFP 的基因编码 Llama 单链抗体，它以高亲和力结合 GFP。因此，使用基因替换方法，可以将 GBP 与锚定蛋白连接起来，然后锚定蛋白会将 GFP 标记的蛋白从其正常位置重新定位到锚定 GBP 蛋白的位置。为了在构巢曲霉中促进这种方法，我们制作了四个碱基质粒盒，可用于通过融合 PCR 生成基因替换 GBP 标签构建体。使用这些基础盒、融合 PCR 和基因打靶方法，我们生成了具有 SPA10-GBP 和 Tom20-GBP 基因替换的菌株。这些菌株能够测试 GFP 标记蛋白分别靶向隔膜或线粒体表面。 SPA10-GBP 可有效地将 GFP 标记蛋白靶向形成和成熟的隔膜。 Tom20-GBP 具有更高的重新定位 GFP 标记蛋白的能力，能够将所有 Nup49-GFP 从核孔复合物 (NPC) 内的位置重新定位到与线粒体相关的细胞质。值得注意的是，从 NPC 中去除 Nup49-GFP 会导致寒冷敏感性，就像删除 nup49 基因一样。所描述的盒构建体促进了在真菌中产生精确的蛋白质-蛋白质连接的实验方法。 A. nidulans SPA10-GBP 和 Tom20-GBP 菌株可用于调节其他 GFP 标记的感兴趣蛋白。
Endogenously tagging proteins with green fluorescent protein (GFP) enables the visualization of the tagged protein using live cell microscopy. GFP-tagging is widely utilized to study biological processes in model experimental organisms including filamentous fungi such as Aspergillus nidulans. Many strains of A. nidulans have therefore been generated with different proteins endogenously tagged with GFP. To further enhance experimental approaches based upon GFP-tagging, we have adapted the GFP Binding Protein (GBP) system for A. nidulans. GBP is a genetically encoded Llama single chain antibody against GFP which binds GFP with high affinity. Using gene replacement approaches, it is therefore possible to link GBP to anchor proteins, which will then retarget GFP-tagged proteins away from their normal location to the location of the anchor-GBP protein. To facilitate this approach in A. nidulans, we made four base plasmid cassettes that can be used to generate gene replacement GBP-tagging constructs by utilizing fusion PCR. Using these base cassettes, fusion PCR, and gene targeting approaches, we generated strains with SPA10-GBP and Tom20-GBP gene replacements. These strains enabled test targeting of GFP-tagged proteins to septa or to the surface of mitochondria respectively. SPA10-GBP is shown to effectively target GFP-tagged proteins to both forming and mature septa. Tom20-GBP has a higher capacity to retarget GFP-tagged proteins being able to relocate all Nup49-GFP from its location within nuclear pore complexes (NPCs) to the cytoplasm in association with mitochondria. Notably, removal of Nup49-GFP from NPCs causes cold sensitivity as does deletion of the nup49 gene. The cassette constructs described facilitate experimental approaches to generate precise protein-protein linkages in fungi. The A. nidulans SPA10-GBP and Tom20-GBP strains can be utilized to modulate other GFP-tagged proteins of interest.
登录
查看更多内容
影响因子：
3.6
作者：
Zhang, Ying;Gao, Xiaolei;Fischer, Reinhard
通讯作者：
Fischer, Reinhard
影响因子：
7.8
作者：
Suresh, Subbulakshmi;Markossian, Sarine;Osmani, Stephen A.
通讯作者：
Osmani, Stephen A.
影响因子：
48
作者：
Rothbauer, Ulrich;Zolghadr, Kourosh;Leonhardt, Heinrich
通讯作者：
Leonhardt, Heinrich
影响因子：
6.4
作者：
Borg, Sarah;Popp, Felix;Schueler, Dirk
通讯作者：
Schueler, Dirk
DOI：
10.1073/pnas.1207467109
发表时间：
2012-09-25
影响因子：
11.1
作者：
Lai, Julian;Koh, Chuan Hock;Jedd, Gregory
通讯作者：
Jedd, Gregory