A Label-Free Assay for Aminoacylation of tRNA.
A Label-Free Assay for Aminoacylation of tRNA.
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DOI：
10.3390/genes11101173
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发表时间：
2020-10-07
期刊：
影响因子：
3.5
通讯作者：
Hou YM
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Gamper H;Hou YM
tRNA 的氨酰化生成氨酰-tRNA (aa-tRNA)，它对核糖体上的蛋白质合成具有活性。 tRNA 氨酰化的定量对于了解 aa-tRNA 进入蛋白质合成机制的特异性机制和通量至关重要，蛋白质合成机制决定细胞生长速率。 tRNA 氨酰化定量的传统测定涉及放射性，使用放射性氨基酸或使用 [3'-32P] 标记的 tRNA。我们在此描述了一种无标记测定，通过生物素化-链霉亲和素 (SA) 与 aa-tRNA 上氨酰基的 α-胺或 α-亚胺缀合来监测氨酰化。缀合的 aa-tRNA 产物很容易通过变性聚丙烯酰胺凝胶与未反应的 tRNA 分离，从而可以定量测量氨酰化。这种无标记测定适用于多种氨基酸和 tRNA 序列以及两类氨酰化。它比使用放射性氨基酸的检测更灵敏、更稳健，并且比使用 [3'-32P] 标记的 tRNA 的检测具有探索更广泛范围的 tRNA 的潜力。这种无标记测定报告的氨酰化动力学参数在定量上与使用放射性氨基酸报告的动力学参数相似，表明其广泛适用于与人类健康和疾病相关的研究。
Aminoacylation of tRNA generates an aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) that is active for protein synthesis on the ribosome. Quantification of aminoacylation of tRNA is critical to understand the mechanism of specificity and the flux of the aa-tRNA into the protein synthesis machinery, which determines the rate of cell growth. Traditional assays for the quantification of tRNA aminoacylation involve radioactivity, either with a radioactive amino acid or with a [3′-32P]-labeled tRNA. We describe here a label-free assay that monitors aminoacylation by biotinylation-streptavidin (SA) conjugation to the α-amine or the α-imine of the aminoacyl group on the aa-tRNA. The conjugated aa-tRNA product is readily separated from the unreacted tRNA by a denaturing polyacrylamide gel, allowing for quantitative measurement of aminoacylation. This label-free assay is applicable to a wide range of amino acids and tRNA sequences and to both classes of aminoacylation. It is more sensitive and robust than the assay with a radioactive amino acid and has the potential to explore a wider range of tRNA than the assay with a [3′-32P]-labeled tRNA. This label-free assay reports kinetic parameters of aminoacylation quantitatively similar to those reported by using a radioactive amino acid, suggesting its broad applicability to research relevant to human health and disease.
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影响因子：
16.6
作者：
Liu, Cuiping;Gamper, Howard;Liu, Hanqing;Cooperman, Barry S.;Hou, Ya-Ming
通讯作者：
Hou, Ya-Ming
影响因子：
4.8
作者：
Ledoux, Sarah;Uhlenbeck, Olke C.
通讯作者：
Uhlenbeck, Olke C.
DOI：
10.1073/pnas.172404099
发表时间：
2002-09-03
影响因子：
11.1
作者：
Hansen, JL;Schmeing, TM;Steitz, TA
通讯作者：
Steitz, TA
影响因子：
4.5
作者：
Liu, Cuiping;Sanders, Jeffrey M.;Hou, Ya-Ming
通讯作者：
Hou, Ya-Ming
影响因子：
14.9
作者：
Jühling F;Mörl M;Hartmann RK;Sprinzl M;Stadler PF;Pütz J
通讯作者：
Pütz J