Quantitative analysis of TALE-DNA interactions suggests polarity effects.
Quantitative analysis of TALE-DNA interactions suggests polarity effects.
复制标题
Tale-DNA相互作用的定量分析表明极性效应。
DOI：
10.1093/nar/gkt085
复制
发表时间：
2013-04
影响因子：
14.9
通讯作者：
Baldwin EP
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Meckler JF;Bhakta MS;Kim MS;Ovadia R;Habrian CH;Zykovich A;Yu A;Lockwood SH;Morbitzer R;Elsäesser J;Lahaye T;Segal DJ;Baldwin EP
转录激活因子样效应子（TALE）已经彻底改变了基因组工程领域。我们在这里提出了一个系统的评估TALE DNA识别，使用定量电泳迁移率变动分析和报告基因激活分析。在TALE蛋白中，串联的34个氨基酸重复序列各自识别一个碱基对，并通过重复可变双残基（RVD）指导序列特异性DNA结合。我们发现RVD选择可以影响亲和力四个数量级，相对RVD贡献的顺序为NG> HD NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NN重复优先选择碱基G而不是A，而NK重复以低103倍的亲和力结合G。我们比较了AvrBs3，一种天然存在的TALE，它使用一些非典型的RVD-碱基组合识别其靶标，与设计的TALE精确匹配“标准”RVD与靶标碱基。该比较揭示了对不变5 ′-T的取代的敏感性的意外差异。另一个令人惊讶的观察结果是靶位点5 ′端的碱基错配比3 ′端的碱基错配对亲和力具有更大的破坏性影响，特别是在设计的TALE中。这些结果提供了证据表明，TALE-DNA识别表现出迄今未描述的极性效应，其中N-末端重复序列比C-末端重复序列对亲和力的贡献更大。
Transcription activator-like effectors (TALEs) have revolutionized the field of genome engineering. We present here a systematic assessment of TALE DNA recognition, using quantitative electrophoretic mobility shift assays and reporter gene activation assays. Within TALE proteins, tandem 34-amino acid repeats recognize one base pair each and direct sequence-specific DNA binding through repeat variable di-residues (RVDs). We found that RVD choice can affect affinity by four orders of magnitude, with the relative RVD contribution in the order NG > HD ∼ NN ≫ NI > NK. The NN repeat preferred the base G over A, whereas the NK repeat bound G with 103-fold lower affinity. We compared AvrBs3, a naturally occurring TALE that recognizes its target using some atypical RVD-base combinations, with a designed TALE that precisely matches ‘standard’ RVDs with the target bases. This comparison revealed unexpected differences in sensitivity to substitutions of the invariant 5′-T. Another surprising observation was that base mismatches at the 5′ end of the target site had more disruptive effects on affinity than those at the 3′ end, particularly in designed TALEs. These results provide evidence that TALE–DNA recognition exhibits a hitherto un-described polarity effect, in which the N-terminal repeats contribute more to affinity than C-terminal ones.
登录
查看更多内容
影响因子：
14.9
作者：
Kim MS;Stybayeva G;Lee JY;Revzin A;Segal DJ
通讯作者：
Segal DJ
影响因子：
64.8
作者：
NELSON, HCM;FINCH, JT;KLUG, A
通讯作者：
KLUG, A
影响因子：
46.9
作者：
Roulet, E;Busso, S;Bucher, P
通讯作者：
Bucher, P
影响因子：
46.9
作者：
通讯作者：
--
DOI：
10.1073/pnas.1013133107
发表时间：
2010-12-14
影响因子：
11.1
作者：
Morbitzer, Robert;Roemer, Patrick;Lahaye, Thomas
通讯作者：
Lahaye, Thomas