Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.
Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.
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DOI：
10.1093/nar/gni035
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发表时间：
2005-02-24
影响因子：
14.9
通讯作者：
Copeland NG
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Warming S;Costantino N;Court DL;Jenkins NA;Copeland NG
重组工程技术使得在大肠杆菌中克隆的DNA能够通过λ（lambda）Red介导的同源重组进行修饰，从而无需使用限制酶和DNA连接酶来修饰DNA。在此，我们描述了三种新的重组工程菌株（SW102、SW105和SW106）的构建，这些菌株允许利用半乳糖激酶（galK）的正负筛选来修饰细菌人工染色体（BACs）。这种两步筛选程序使得在修饰位点不引入不需要的选择标记的情况下对DNA进行修饰。这三种菌株都含有一个除此之外完整的半乳糖操纵子，只是galK基因被精确缺失，并且含有一个有缺陷的温度敏感型λ原噬菌体，这使得重组工程成为可能。SW105和SW106细胞另外分别携带可由L - 阿拉伯糖诱导的Cre或Flp基因。galK功能可进行正向和反向筛选。这一特性大大降低了在其他负筛选方案中出现的背景，并且galK筛选比已发表的其他相关筛选方法效率高得多。我们还展示了如何利用galK筛选将点突变、缺失和loxP位点快速引入BAC DNA中，从而促进对单核苷酸多态性（SNP）和/或致病点突变的功能研究、远程调控元件的鉴定以及条件性靶向载体的构建。
Recombineering allows DNA cloned in Escherichia coli to be modified via lambda (λ) Red-mediated homologous recombination, obviating the need for restriction enzymes and DNA ligases to modify DNA. Here, we describe the construction of three new recombineering strains (SW102, SW105 and SW106) that allow bacterial artificial chromosomes (BACs) to be modified using galK positive/negative selection. This two-step selection procedure allows DNA to be modified without introducing an unwanted selectable marker at the modification site. All three strains contain an otherwise complete galactose operon, except for a precise deletion of the galK gene, and a defective temperature-sensitive λ prophage that makes recombineering possible. SW105 and SW106 cells in addition carry l-arabinose-inducible Cre or Flp genes, respectively. The galK function can be selected both for and against. This feature greatly reduces the background seen in other negative-selection schemes, and galK selection is considerably more efficient than other related selection methods published. We also show how galK selection can be used to rapidly introduce point mutations, deletions and loxP sites into BAC DNA and thus facilitate functional studies of SNP and/or disease-causing point mutations, the identification of long-range regulatory elements and the construction of conditional targeting vectors.
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DOI：
10.1073/pnas.1232375100
发表时间：
2003-06-10
影响因子：
11.1
作者：
Yu, DG;Sawitzke, JA;Court, DL
通讯作者：
Court, DL
影响因子：
14.9
作者：
Muyrers, JPP;Zhang, YM;Stewart, AF
通讯作者：
Stewart, AF
影响因子：
3.2
作者：
ALPER, MD;AMES, BN
通讯作者：
AMES, BN
DOI：
10.1073/pnas.89.18.8794
发表时间：
1992-09-15
影响因子：
11.1
作者：
SHIZUYA, H;BIRREN, B;SIMON, M
通讯作者：
SIMON, M
影响因子：
7
作者：
Gong, SC;Yang, XW;Heintz, N
通讯作者：
Heintz, N