Rapid generation of endogenously driven transcriptional reporters in cells through CRISPR/Cas9.
Rapid generation of endogenously driven transcriptional reporters in cells through CRISPR/Cas9.
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DOI：
10.1038/srep09811
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发表时间：
2015-04-29
影响因子：
4.6
通讯作者：
Sapkota GP
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Rojas-Fernandez A;Herhaus L;Macartney T;Lachaud C;Hay RT;Sapkota GP
CRISPR/Cas9技术已被用于基因组编辑，以实现体细胞中的基因敲除和敲入。类似地，某些内源性基因已经用荧光蛋白标记。通常，标记蛋白的检测需要高表达和复杂的工具，如共聚焦显微镜和流式细胞术。因此，一个简单，灵敏和强大的转录报告系统驱动的内源性启动子的转录调控的研究是可取的。我们报告了一种基于CRISPR/Cas9的方法，用于在内源性启动子的控制下，使用TGFβ响应基因派-1将萤火虫荧光素酶基因快速整合到体细胞中。我们的策略采用含有非融合GFP蛋白的多顺反子盒，以确保检测转基因递送和快速分离阳性克隆。我们证明萤火虫荧光素酶cDNA可以有效地传递到TGFβ-反应基因派-1的启动子下游。使用TGFβ信号传导的化学和遗传调节剂，我们表明它模拟内源性派-1表达的转录调节。我们独特的方法有可能加快在体细胞中天然染色质景观背景下对任何基因转录的研究，从而实现强大的高通量化学和遗传筛选。
CRISPR/Cas9 technologies have been employed for genome editing to achieve gene knockouts and knock-ins in somatic cells. Similarly, certain endogenous genes have been tagged with fluorescent proteins. Often, the detection of tagged proteins requires high expression and sophisticated tools such as confocal microscopy and flow cytometry. Therefore, a simple, sensitive and robust transcriptional reporter system driven by endogenous promoter for studies into transcriptional regulation is desirable. We report a CRISPR/Cas9-based methodology for rapidly integrating a firefly luciferase gene in somatic cells under the control of endogenous promoter, using the TGFβ-responsive gene PAI-1. Our strategy employed a polycistronic cassette containing a non-fused GFP protein to ensure the detection of transgene delivery and rapid isolation of positive clones. We demonstrate that firefly luciferase cDNA can be efficiently delivered downstream of the promoter of the TGFβ-responsive gene PAI-1. Using chemical and genetic regulators of TGFβ signalling, we show that it mimics the transcriptional regulation of endogenous PAI-1 expression. Our unique approach has the potential to expedite studies on transcription of any gene in the context of its native chromatin landscape in somatic cells, allowing for robust high-throughput chemical and genetic screens.
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影响因子：
14.9
作者：
Hu J;Lei Y;Wong WK;Liu S;Lee KC;He X;You W;Zhou R;Guo JT;Chen X;Peng X;Sun H;Huang H;Zhao H;Feng B
通讯作者：
Feng B
DOI：
10.1038/nrg3454
发表时间：
2013-06
期刊：
Nature reviews. Genetics
影响因子：
--
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
3.7
作者：
Li K;Wang G;Andersen T;Zhou P;Pu WT
通讯作者：
Pu WT
影响因子：
3.9
作者：
Mehta, R.;Shapiro, A. D.
通讯作者：
Shapiro, A. D.
DOI：
10.1126/science.1232033
发表时间：
2013-02-15
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Mali P;Yang L;Esvelt KM;Aach J;Guell M;DiCarlo JE;Norville JE;Church GM
通讯作者：
Church GM