Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.
Negative selection and stringency modulation in phage-assisted continuous evolution.
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DOI：
10.1038/nchembio.1453
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发表时间：
2014-03
影响因子：
14.8
通讯作者：
Liu, David R.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Carlson, Jacob C.;Badran, Ahmed H.;Guggiana-Nilo, Drago A.;Liu, David R.
噬菌体辅助连续进化（PACE）使用改良的丝状噬菌体生命周期来显著加快实验室进化实验。在这项工作中，我们通过两个关键进展扩展了PACE方法的范围和能力，使生物分子的进化具有根本改变或高度特异性的新活性。首先，我们实现了选择严格性的小分子控制调制，使原本不可接近的活性能够通过一段时间的进化漂变直接从不活跃的起始文库进化而来。其次，我们开发了一种通用的消极选择，使持续的反选择能够对抗不希望的活动。在为期三天的PACE实验中，我们整合了这些发展，不断进化突变的T7 RNA聚合酶，其底物特异性改变了~ 10,000倍，而不仅仅是扩大了。进化的酶对其目标底物的特异性超过了野生型RNA聚合酶对其同源底物的特异性，同时保持了野生型的活性水平。
Phage-assisted continuous evolution (PACE) uses a modified filamentous bacteriophage life cycle to dramatically accelerate laboratory evolution experiments. In this work we expand the scope and capabilities of the PACE method with two key advances that enable the evolution of biomolecules with radically altered or highly specific new activities. First, we implemented small molecule-controlled modulation of selection stringency that enables otherwise inaccessible activities to be evolved directly from inactive starting libraries through a period of evolutionary drift. Second, we developed a general negative selection that enables continuous counter-selection against undesired activities. We integrated these developments to continuously evolve mutant T7 RNA polymerase enzymes with ∼10,000-fold altered, rather than merely broadened, substrate specificities during a single three-day PACE experiment. The evolved enzymes exhibit specificity for their target substrate that exceeds that of wild-type RNA polymerases for their cognate substrates, while maintaining wild-type-like levels of activity.
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