Internally ratiometric fluorescent sensors for evaluation of intracellular GTP levels and distribution.
Internally ratiometric fluorescent sensors for evaluation of intracellular GTP levels and distribution.
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DOI：
10.1038/nmeth.4404
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发表时间：
2017-10
期刊：
影响因子：
48
通讯作者：
Nikiforov MA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bianchi-Smiraglia A;Rana MS;Foley CE;Paul LM;Lipchick BC;Moparthy S;Moparthy K;Fink EE;Bagati A;Hurley E;Affronti HC;Bakin AV;Kandel ES;Smiraglia DJ;Feltri ML;Sousa R;Nikiforov MA
GTP是多种细胞过程的主要调节剂，但用于定量评价活细胞中GTP水平的工具尚未获得。在这里，我们报告表征的基因编码的GTP传感器，构建通过插入cpYFP到一个区域的细菌FeoB G-蛋白，经历了GTP驱动的构象变化。GTP与这些传感器的结合导致其荧光的比率变化，从而提供对GTP水平变化的内部归一化响应，同时最小地干扰这些水平。引入FeoB以改变其对GTP的亲和力的突变允许产生具有宽动态范围的传感器。重要的是，在哺乳动物细胞中，传感器在GTP池耗尽或恢复后显示荧光强度比的一致变化。这些传感器适用于检测活细胞中GTP水平的时空变化，并适用于开发调节细胞内GTP水平的分子的高通量筛选。
GTP is a major regulator of multiple cellular processes, but tools for quantitative evaluation of GTP levels in live cells have not been available. Here we report characterization of genetically encoded GTP sensors, constructed by inserting cpYFP into a region of the bacterial FeoB G-protein that undergoes a GTP-driven conformational change. GTP binding to these sensors results in a ratiometric change in their fluorescence, thereby providing an internally normalized response to changes in GTP levels while minimally perturbing those levels. Mutations introduced into FeoB to alter its affinity for GTP allowed generation of sensors with a wide dynamic range. Critically, in mammalian cells the sensors show consistent changes in fluorescence intensity ratios upon depletion or restoration of GTP pools. These sensors are suitable for detecting spatio-temporal changes in GTP levels in living cells, and for the development of high throughput screenings of molecules modulating intracellular GTP levels.
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