A high-throughput assay for directly monitoring nucleolar rRNA biogenesis.
A high-throughput assay for directly monitoring nucleolar rRNA biogenesis.
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DOI：
10.1098/rsob.210305
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发表时间：
2022-01
期刊：
影响因子：
5.8
通讯作者：
Baserga SJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bryant CJ;McCool MA;Abriola L;Surovtseva YV;Baserga SJ
核仁功能调控的研究对于更清楚地了解核糖体生物发生（RB）的基本生物学基础，以及未来治疗癌症和核糖体疾病的治疗方法的发展至关重要。一些基于核仁形态改变的高通量初级分析可以间接识别影响RB的撞击。然而，需要一种更直接的高通量核仁功能检测来进一步评估命中。以前的报道使用5-乙基尿苷（5-EU）低通量监测核核rRNA的生物发生。我们报告了一种小型化、高通量的5-EU检测方法，该方法基于核仁蛋白纤维蛋白（FBL）的共染色，能够特异性计算核仁rRNA生物发生抑制。该试验使用两种siRNA对照：阴性非靶向siRNA对照和靶向RNA聚合酶1 （RNAP1; POLR1A）的阳性siRNA对照，并具体量化核核内的中位5-EU信号。最大核5-EU信号也可用于监测假定的RNAP1小分子抑制剂的效果，如BMH-21，或其他导致FBL分散的处理条件。我们在高通量初级筛选中验证了68个主要核仁点的5-EU检测，结果显示58/68个点显著抑制核仁rRNA的生物发生。我们的新方法建立了高通量的直接定量核仁功能，促进了RB在健康和疾病中的更深入研究。
Studies of the regulation of nucleolar function are critical for ascertaining clearer insights into the basic biological underpinnings of ribosome biogenesis (RB), and for future development of therapeutics to treat cancer and ribosomopathies. A number of high-throughput primary assays based on morphological alterations of the nucleolus can indirectly identify hits affecting RB. However, there is a need for a more direct high-throughput assay for a nucleolar function to further evaluate hits. Previous reports have monitored nucleolar rRNA biogenesis using 5-ethynyl uridine (5-EU) in low-throughput. We report a miniaturized, high-throughput 5-EU assay that enables specific calculation of nucleolar rRNA biogenesis inhibition, based on co-staining of the nucleolar protein fibrillarin (FBL). The assay uses two siRNA controls: a negative non-targeting siRNA control and a positive siRNA control targeting RNA Polymerase 1 (RNAP1; POLR1A), and specifically quantifies median 5-EU signal within nucleoli. Maximum nuclear 5-EU signal can also be used to monitor the effects of putative small-molecule inhibitors of RNAP1, like BMH-21, or other treatment conditions that cause FBL dispersion. We validate the 5-EU assay on 68 predominately nucleolar hits from a high-throughput primary screen, showing that 58/68 hits significantly inhibit nucleolar rRNA biogenesis. Our new method establishes direct quantification of nucleolar function in high-throughput, facilitating closer study of RB in health and disease.
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影响因子：
14.9
作者：
Dong C;An L;Yu CH;Huen MSY
通讯作者：
Huen MSY
DOI：
10.1002/cpz1.89
发表时间：
2021-05
期刊：
Current protocols
影响因子：
--
作者：
Dobson ETA;Cimini B;Klemm AH;Wählby C;Carpenter AE;Eliceiri KW
通讯作者：
Eliceiri KW
影响因子：
12.3
作者：
Carpenter AE;Jones TR;Lamprecht MR;Clarke C;Kang IH;Friman O;Guertin DA;Chang JH;Lindquist RA;Moffat J;Golland P;Sabatini DM
通讯作者：
Sabatini DM
影响因子：
5.3
作者：
Engel, Krysta L.;French, Sarah L.;Schneider, David A.
通讯作者：
Schneider, David A.
影响因子：
5.6
作者：
Dvořáčková M;Fajkus J
通讯作者：
Fajkus J