A stress-free strategy to correct point mutations in patient iPS cells.
A stress-free strategy to correct point mutations in patient iPS cells.
复制标题
纠正患者 iPS 细胞点突变的无压力策略。
DOI：
10.1016/j.scr.2021.102332
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发表时间：
2021-05
影响因子：
1.2
通讯作者：
Iacovitti L
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Cai J;Kropf E;Hou YM;Iacovitti L
当研究患者特异性诱导多能干细胞（iPS细胞）作为疾病模型时，理想的对照是已纠正点突变的等基因系，而不是来自同胞或其他健康受试者的iPS细胞。然而，即使使用新开发的CRISPR-Cas9技术修复iPS细胞中的点突变仍然困难且耗时。在这里，我们报告了一种使Cas9“敲入”方法既无麻烦又无错误的策略。我们没有选择接近点突变的Cas9识别位点，而是选择了位于最近内含子中的位点。我们构建了一个供体模板，其中包含校正的点突变的片段作为PGK-PuroR盒侧翼的同源重组臂之一。用嘌呤霉素选择后，鉴定阳性克隆，并进一步用CRE载体转染以除去PGK-PuroR盒。使用这种方法，我们成功地修复了帕金森病（PD）患者iPS系中LRRK 2基因的点突变G2019 S和腓骨肌萎缩症（CMT）患者iPS系中AARS 1基因的点突变R329 H。这些同基因iPS系是未来研究中理想的对照。
When studying patient specific induced pluripotent stem cells (iPS cells) as a disease model, the ideal control is an isogenic line that has corrected the point mutation, instead of iPS cells from siblings or other healthy subjects. However, repairing a point mutation in iPS cells even with the newly developed CRISPR-Cas9 technique remains difficult and time-consuming. Here we report a strategy that makes the Cas9 “knock-in” methodology both hassle-free and error-free. Instead of selecting a Cas9 recognition site close to the point mutation, we chose a site located in the nearest intron. We constructed a donor template with the fragment containing the corrected point mutation as one of the homologous recombination arms flanking a PGK-PuroR cassette. After selection with puromycin, positive clones were identified and further transfected with a CRE vector to remove the PGK-PuroR cassette. Using this methodology, we successfully repaired the point mutation G2019S of the LRRK2 gene in a Parkinson Disease (PD) patient iPS line and the point mutation R329H of the AARS1 gene in a Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) patient iPS line. These isogenic iPS lines are ideal as a control in future studies.
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影响因子：
4
作者：
Goldwurm, S;Di Fonzo, A;Bonifati, V
通讯作者：
Bonifati, V
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作者：
Harmsen T;Klaasen S;van de Vrugt H;Te Riele H
通讯作者：
Te Riele H
影响因子：
64.8
作者：
Komor AC;Kim YB;Packer MS;Zuris JA;Liu DR
通讯作者：
Liu DR
DOI：
10.1073/pnas.0507360102
发表时间：
2005-11-15
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11.1
作者：
West, AB;Moore, DJ;Dawson, TM
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Dawson, TM
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作者：
Armstrong GA;Liao M;You Z;Lissouba A;Chen BE;Drapeau P
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Drapeau P