Massively parallel kinetic profiling of natural and engineered CRISPR nucleases.
Massively parallel kinetic profiling of natural and engineered CRISPR nucleases.
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DOI：
10.1038/s41587-020-0646-5
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发表时间：
2021-01
影响因子：
46.9
通讯作者：
Finkelstein, Ilya J.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Jones, Stephen K., Jr.;Hawkins, John A.;Johnson, Nicole V.;Jung, Cheulhee;Hu, Kuang;Rybarski, James R.;Chen, Janice S.;Doudna, Jennifer A.;Press, William H.;Finkelstein, Ilya J.
与野生型 (wt) Cas9 相比，工程化 SpCas9 和 AsCas12a 切割的脱靶基因组位点更少。然而，了解它们的保真度、机制和切割结果需要对错误配对的目标 DNA 进行系统分析。在这里，我们描述了 NucleaSeq（核酸酶消化和深度测序），这是一个大规模并行平台，可测量 10,000 多个含有相对于指导 RNA 的错配、插入和缺失的靶标的切割动力学和时间分辨切割产物。结合同一目标库的切割率和结合特异性，我们对五个 SpCas9 变体和 AsCas12a 进行了基准测试。根据这些数据集构建的生物物理模型揭示了对脱靶裂解的机制见解。与 wtCas9 相比，工程化 Cas9，尤其是 Cas9-HF1，显着提高了切割特异性，但没有结合特异性。令人惊讶的是，AsCas12a 的切割特异性与 wtCas9 的差异不大。初始 DNA 切割位点和末端修剪因核酸酶、引导 RNA 和错配核苷酸的位置而异。更广泛地说，NucleaSeq 能够对工程核酸酶和天然核酸酶的特异性和切割结果进行快速、定量和系统的比较。
Engineered SpCas9s and AsCas12a cleave fewer off-target genomic sites than wild-type (wt) Cas9. However, understanding their fidelity, mechanisms and cleavage outcomes requires systematic profiling across mispaired target DNAs. Here we describe NucleaSeq—nuclease digestion and deep sequencing—a massively parallel platform that measures the cleavage kinetics and time-resolved cleavage products for over 10,000 targets containing mismatches, insertions and deletions relative to the guide RNA. Combining cleavage rates and binding specificities on the same target libraries, we benchmarked five SpCas9 variants and AsCas12a. A biophysical model built from these data sets revealed mechanistic insights into off-target cleavage. Engineered Cas9s, especially Cas9-HF1, dramatically increased cleavage specificity but not binding specificity compared to wtCas9. Surprisingly, AsCas12a cleavage specificity differed little from that of wtCas9. Initial DNA cleavage sites and end trimming varied by nuclease, guide RNA and the positions of mispaired nucleotides. More broadly, NucleaSeq enables rapid, quantitative and systematic comparisons of specificity and cleavage outcomes across engineered and natural nucleases.
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影响因子：
48
作者：
Anderson KR;Haeussler M;Watanabe C;Janakiraman V;Lund J;Modrusan Z;Stinson J;Bei Q;Buechler A;Yu C;Thamminana SR;Tam L;Sowick MA;Alcantar T;O'Neil N;Li J;Ta L;Lima L;Roose-Girma M;Rairdan X;Durinck S;Warming S
通讯作者：
Warming S
影响因子：
46.9
作者：
Doench JG;Fusi N;Sullender M;Hegde M;Vaimberg EW;Donovan KF;Smith I;Tothova Z;Wilen C;Orchard R;Virgin HW;Listgarten J;Root DE
通讯作者：
Root DE
Biopython：用于计算分子生物学和生物信息学的免费 Python 工具。
DOI：
10.1093/bioinformatics/btp163
发表时间：
2009-06-01
期刊：
Bioinformatics (Oxford, England)
影响因子：
--
作者：
Cock PJ;Antao T;Chang JT;Chapman BA;Cox CJ;Dalke A;Friedberg I;Hamelryck T;Kauff F;Wilczynski B;de Hoon MJ
通讯作者：
de Hoon MJ
影响因子：
48
作者：
Crosetto, Nicola;Mitra, Abhishek;Silva, Maria Joao;Bienko, Magda;Dojer, Norbert;Wang, Qi;Karaca, Elif;Chiarle, Roberto;Skrzypczak, Magdalena;Ginalski, Krzysztof;Pasero, Philippe;Rowicka, Maga;Dikic, Ivan
通讯作者：
Dikic, Ivan
CRISPR-CAS9介导的基因失活的高度活性SGRNA的合理设计。
影响因子：
46.9
作者：
Doench, John G.;Hartenian, Ella;Graham, Daniel B.;Tothova, Zuzana;Hegde, Mudra;Smith, Ian;Sullender, Meagan;Ebert, Benjamin L.;Xavier, Ramnik J.;Root, David E.
通讯作者：
Root, David E.