Efficient fractionation and analysis of ribosome assembly intermediates in human cells.
Efficient fractionation and analysis of ribosome assembly intermediates in human cells.
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DOI：
10.1080/15476286.2021.1965754
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发表时间：
2021-10-15
期刊：
影响因子：
4.1
通讯作者：
Dosil M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Nieto B;Gaspar SG;Sapio RT;Clavaín L;Bustelo XR;Pestov DG;Dosil M
人类核糖体合成途径的生物化学研究一直受到从核仁内部区域获得完整的前核糖体复合物的技术困难的阻碍。在这里，我们提供了一个提取方法，使有效的检测，分离和表征核仁前核糖体含有大前rRNA物种的详细描述。三步前核糖体顺序提取（PSE）方案保留了早期前核糖体复合物的完整性，并从少量的起始材料中产生适于生化分析的制剂。我们通过检测特异性反式作用因子和前体核糖体中的前体核糖体，使用亲和矩阵下拉和沉降分析来验证这一过程。此外，我们描述了应用PSE方法监测细胞水平的无核糖体的5S RNP复合物作为核糖体生物发生应激的指标。我们优化的实验程序将促进在正常，突变和应激细胞的情况下，包括候选核糖体生物合成因子的表征，在特定的生理条件下的前核糖体相互作用或药物对核糖体成熟的影响，人类核糖体生物合成的研究。
Biochemical studies of the human ribosome synthesis pathway have been hindered by technical difficulties in obtaining intact preribosomal complexes from internal regions of the nucleolus. Here we provide a detailed description of an extraction method that enables efficient detection, isolation, and characterization of nucleolar preribosomes containing large pre-rRNA species. The three-step Preribosome Sequential Extraction (PSE) protocol preserves the integrity of early preribosomal complexes and yields preparations amenable to biochemical analyses from low amounts of starting material. We validate this procedure through the detection of specific trans-acting factors and pre-rRNAs in the extracted preribosomes using affinity matrix pull-downs and sedimentation assays. In addition, we describe the application of the PSE method for monitoring cellular levels of ribosome-free 5S RNP complexes as an indicator of ribosome biogenesis stress. Our optimized experimental procedures will facilitate studies of human ribosome biogenesis in normal, mutant and stressed-cell scenarios, including the characterization of candidate ribosome biogenesis factors, preribosome interactors under specific physiological conditions or effects of drugs on ribosome maturation.
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