E. coli surface display of streptavidin for directed evolution of an allylic deallylase.
E. coli surface display of streptavidin for directed evolution of an allylic deallylase.
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DOI：
10.1039/c8sc00484f
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发表时间：
2018-06-28
期刊：
影响因子：
8.4
通讯作者：
Ward TR
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Heinisch T;Schwizer F;Garabedian B;Csibra E;Jeschek M;Vallapurackal J;Pinheiro VB;Marlière P;Panke S;Ward TR
一种人工脱烯丙基酶被构建在大肠杆菌表面，并对笼养的氨基香豆素的去保护进行了遗传优化。人工金属酶(以下简称ARM)结合了均相催化剂和酶的吸引人的特性，为在活体中实现新的自然反应提供了可能性。在这里，我们提出了一种基于LPP-OmpA锚点的链霉亲和素大肠杆菌表面展示平台(以下简称SAV)。该系统被用于高通量筛选基于CpRu的生物正交人工脱烯丙基酶(ADAse)，该酶连接由烯丙基氨基甲酸酯保护的氨基香豆素1。经过两轮定向进化，获得了双突变体S112M-K121A，其表面活性是细胞背景的36倍，体外活性是野生型酶的5.7倍。最好的ADAse的晶体结构揭示了突变S112M对稳定蛋白质内辅因子构象的重要性。
An artificial deallylase is constituted on the E. coli surface and genetically optimized for the deprotection of caged aminocoumarin. Artificial metalloenzymes (ArMs hereafter) combine attractive features of both homogeneous catalysts and enzymes and offer the potential to implement new-to-nature reactions in living organisms. Herein we present an E. coli surface display platform for streptavidin (Sav hereafter) relying on an Lpp-OmpA anchor. The system was used for the high throughput screening of a bioorthogonal CpRu-based artificial deallylase (ADAse) that uncages an allylcarbamate-protected aminocoumarin 1. Two rounds of directed evolution afforded the double mutant S112M–K121A that displayed a 36-fold increase in surface activity vs. cellular background and a 5.7-fold increased in vitro activity compared to the wild type enzyme. The crystal structure of the best ADAse reveals the importance of mutation S112M to stabilize the cofactor conformation inside the protein.
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