Expedient synthesis of a modular phosphate affinity reagent.
Expedient synthesis of a modular phosphate affinity reagent.
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DOI：
10.1021/bc900538b
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发表时间：
2010-06-16
影响因子：
4.7
通讯作者：
Harbury, Pehr A. B.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Tilmans, Nicolas P.;Krusemark, Casey J.;Harbury, Pehr A. B.
分离和鉴定磷酸化大分子对于大多数生物调节网络的去卷积是必不可少的。小池百合子和他的同事最近报道了一种双核锌(吡啶甲基)胺络合物在磷酸盐特异性亲和纯化中的应用，并给它起了一个缩写：PHOS-TAG。这种络合物对于研究磷酸化很有价值，因为它在生理pH下存在酸性官能团的情况下选择性地与磷酸二阴离子结合，而且这种结合在很大程度上与分子环境无关。PHOS-Tag的这些性质使其在磷酸蛋白质组学、代谢组学和核酸生物学中得到了应用。问题是，这种分子很难制造，而且购买起来昂贵得令人望而却步。在这里，我们描述了一种高效、廉价的具有多功能炔柄的PHOS-TAG衍生物的合成方法。炔柄允许通过铜(I)催化的叠氮化物-炔环加成反应(点击化学)将Phos-Tag连接到烷基叠氮化合物上。我们在各种实验分析中表征了新的PHOS-TAG衍生物的磷酸盐结合行为，包括它与荧光报告分子、丙烯酰胺凝胶和琼脂糖层析树脂的结合。我们报道的合成应该能够使PHOS-TAG作为分析和制备试剂在与磷酸盐相关的生物化学中得到更广泛的使用。
Isolation and identification of phosphorylated macromolecules is essential for the deconvolution of most biological regulatory networks. Koike and coworkers recently reported the application of a dinuclear zinc-(pyridylmethyl)amine complex to phosphate-specific affinity purifications, and gave it the shorthand name “phos-tag”. This complex is valuable for studying phosphorylation because it binds selectively to phosphate dianion in the presence of acidic functional groups at physiological pH, and because the binding is largely independent of molecular context. These properties of phos-tag recommend it for applications in phosphoproteomics, metabolomics and nucleic acid biology. The catch has been that the molecule is difficult to make, and prohibitively expensive to buy. Here we describe an efficient and inexpensive synthesis of a phos-tag derivative with a versatile alkyne handle. The alkyne handle allows for attachment of phos-tag to alkyl azides via the copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition reaction (“click chemistry”). We characterize the phosphate binding behavior of the new phos-tag derivative in a variety of experimental assays, including its conjugation to a fluorescent reporter, to acrylamide gels, and to sepharose chromatography resin. The synthesis we report should enable a broader use of phos-tag for phosphate-related biochemistry, as both an analytical and as a preparative reagent.
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