Intra-Molecular Homologous Recombination of Scarless Plasmid
Intra-Molecular Homologous Recombination of Scarless Plasmid
复制标题
无疤质粒的分子内同源重组
DOI：
10.3390/ijms21051697
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发表时间：
2020-03
影响因子：
5.6
通讯作者：
Liu Liangwei
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Liang Yaping;Zhang Yu;Liu Liangwei
尽管已经报道了许多方法，但质粒构建会使质粒效率（每ng DNA的转化体数目）与质粒准确性（无瘢痕质粒的比率）折衷。一种有效的方法是两步PCR扩增DNA。一种准确的方法是用于同源重组（HR）的ExnaseII克隆。我们将联合收割机DNA扩增技术与HR技术相结合，通过扩增质粒DNA使其5′端和3′端具有同源性，并在体外重组质粒DNA，从而建立了分子内HR。以构建质粒pET 20 b-AdD为例，通过平行构建质粒pET 21 a-AdD和pET 22 b-AdD，验证了其通用性。具有30-bp同源臂的DNA是分子内HR的最佳选择，其转化产生14.2个转化子/ng和90%无瘢痕质粒，高于两步PCR和ExnaseII克隆。转化效率与HR产物的切口环状质粒DNA组分相关，表明体内切口修饰导致瘢痕质粒。
Although many methods have been reported, plasmid construction compromises transformant efficiency (number of transformants per ng of DNAs) with plasmid accuracy (rate of scarless plasmids). An efficient method is two-step PCR serving DNA amplification. An accurate method is ExnaseII cloning serving homology recombination (HR). We combine DNA amplification and HR to develop an intra-molecular HR by amplifying plasmid DNAs to contain homology 5′- and 3′-terminus and recombining the plasmid DNAs in vitro. An example was to construct plasmid pET20b-AdD. The generality was checked by constructing plasmid pET21a-AdD and pET22b-AdD in parallel. The DNAs having 30-bp homology arms were optimal for intra-molecular HR, and transformation of which created 14.2 transformants/ng and 90% scarless plasmids, more than the two-step PCR and the ExnaseII cloning. Transformant efficiency correlated with the component of nicked circular plasmid DNAs of HR products, indicating nick modification in vivo leads to scar plasmids.
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