Minimized combinatorial CRISPR screens identify genetic interactions in autophagy.
Minimized combinatorial CRISPR screens identify genetic interactions in autophagy.
复制标题
DOI：
10.1093/nar/gkab309
复制
发表时间：
2021-06-04
影响因子：
14.9
通讯作者：
Kaulich M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Diehl V;Wegner M;Grumati P;Husnjak K;Schaubeck S;Gubas A;Shah VJ;Polat IH;Langschied F;Prieto-Garcia C;Müller K;Kalousi A;Ebersberger I;Brandts CH;Dikic I;Kaulich M
组合CRISPR-Cas筛选推进了遗传相互作用的作图，但其实验规模限制了可靶向基因组合的数量。在这里，我们描述了3Cs多路复用，这是一种快速且可扩展的方法，用于生成高度多样且均匀分布的组合CRISPR文库。我们证明了库分布偏斜是其所需的筛选覆盖率的关键决定因素。通过避免PCR扩增的寡核苷酸的迭代克隆，3Cs多重化促进了具有低分布偏差的组合CRISPR文库的生成。我们表明，组合3Cs库可以用最小的覆盖率进行筛选，减少相关的工作和成本至少10倍。我们将靶向12，736个自噬基因组合与247，032个成对gRNA的3Cs多重文库应用于活力和基于细胞的富集筛选。在活力筛选中，我们鉴定了合成致死WDR 45 B-PIK 3R 4和增殖增强ATG 7-KEAP 1遗传相互作用等。在基于基因组的筛选中，我们确定了超过1，570种自噬通量的基本遗传相互作用，包括旁系同源基因之间的相互作用，即ATG 2A-ATG 2B，GABARAP-MAP 1 LC 3B和GABARAP-GABARAPL 2。然而，我们只观察到很少的遗传相互作用的旁系同源基因家族的两个以上的成员，表明功能之间的补偿。这项工作建立了3Cs多路复用作为大规模遗传相互作用筛选的平台。
Combinatorial CRISPR-Cas screens have advanced the mapping of genetic interactions, but their experimental scale limits the number of targetable gene combinations. Here, we describe 3Cs multiplexing, a rapid and scalable method to generate highly diverse and uniformly distributed combinatorial CRISPR libraries. We demonstrate that the library distribution skew is the critical determinant of its required screening coverage. By circumventing iterative cloning of PCR-amplified oligonucleotides, 3Cs multiplexing facilitates the generation of combinatorial CRISPR libraries with low distribution skews. We show that combinatorial 3Cs libraries can be screened with minimal coverages, reducing associated efforts and costs at least 10-fold. We apply a 3Cs multiplexing library targeting 12,736 autophagy gene combinations with 247,032 paired gRNAs in viability and reporter-based enrichment screens. In the viability screen, we identify, among others, the synthetic lethal WDR45B-PIK3R4 and the proliferation-enhancing ATG7-KEAP1 genetic interactions. In the reporter-based screen, we identify over 1,570 essential genetic interactions for autophagy flux, including interactions among paralogous genes, namely ATG2A-ATG2B, GABARAP-MAP1LC3B and GABARAP-GABARAPL2. However, we only observe few genetic interactions within paralogous gene families of more than two members, indicating functional compensation between them. This work establishes 3Cs multiplexing as a platform for genetic interaction screens at scale.
登录
查看更多内容
DOI：
10.1093/bioinformatics/btu638
发表时间：
2015-01-15
期刊：
Bioinformatics (Oxford, England)
影响因子：
--
作者：
Anders S;Pyl PT;Huber W
通讯作者：
Huber W
影响因子：
5.6
作者：
Ford K;McDonald D;Mali P
通讯作者：
Mali P
影响因子：
12.3
作者：
Dang Y;Jia G;Choi J;Ma H;Anaya E;Ye C;Shankar P;Wu H
通讯作者：
Wu H
影响因子：
46.9
作者：
Doench JG;Fusi N;Sullender M;Hegde M;Vaimberg EW;Donovan KF;Smith I;Tothova Z;Wilen C;Orchard R;Virgin HW;Listgarten J;Root DE
通讯作者：
Root DE
影响因子：
12.3
作者：
Dede M;McLaughlin M;Kim E;Hart T
通讯作者：
Hart T