Phosphorylation of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase: experience with a GST-fusion protein and a new pull-down assay.
Phosphorylation of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase: experience with a GST-fusion protein and a new pull-down assay.
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O6-烷基鸟嘌呤-DNA 烷基转移酶的磷酸化：GST 融合蛋白和新 Pull-down 测定的经验。
DOI：
10.1016/s0304-3835(01)00823-0
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发表时间：
2002
期刊：
影响因子：
9.7
通讯作者：
Ali-Osman,Francis
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Srivenugopal,KalkunteS;Mullapudi,SrinivasRS;Ali-Osman,Francis
我们最近发现，人O 6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶（AGT），一个关键的目标，提高抗癌烷化剂的疗效，是由脑肿瘤细胞中的磷酸化调节。这份报告描述了我们遇到的问题，在使用谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的AGT作为底物，在我们的搜索细胞AGT激酶，验证一种新的下拉分析AGT磷酸化，其广泛适用于定量蛋白激酶的粗提取物和纯化馏分。发现融合蛋白中存在的GST标签本身被肿瘤细胞提取物显著磷酸化并导致假结果。相反，我们使用了组氨酸标记的AGT蛋白，其微量纯化与Talon树脂作为定量下拉测定的基础，并将其应用于测量AGT磷酸化蛋白激酶C（PKC）和其他细胞激酶。下拉程序可以很容易地采用定量蛋白激酶在各种设置，因为它克服了需要底物免疫沉淀时，使用全细胞提取物，并消除了自磷酸化的激酶蛋白，当使用纯化的激酶。我们的观察呼吁谨慎解释结果与GST融合蛋白的磷酸化研究。
We showed recently that human O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase (AGT), a key target for enhancing the efficacy of anticancer alkylating agents, is regulated by phosphorylation in brain tumor cells. This report describes the problems we encountered in using a glutathione S-transferase (GST)-tagged AGT as the substrate in our search for cellular AGT kinases, validation of a new pull-down assay for AGT phosphorylation, and its wide applicability for quantitating protein kinases in crude extracts and purified fractions. The GST-tag present in the fusion protein, by itself, was found to undergo significant phosphorylation by tumor cell extracts and contribute to spurious results. Instead, we used a histidine-tagged AGT protein, and its micro-scale purification with Talon resin as the basis for a quantitative pull-down assay, and applied it for measuring AGT phosphorylation by protein kinase C (PKC) and other cellular kinases. The pull-down procedure can be easily adopted for quantitating protein kinases in a variety of settings, as it overcomes the need for substrate immunoprecipitation when whole cell extracts are used, and eliminates the autophosphorylated kinase proteins, when purified kinases are used. Our observations call for caution in interpreting the results with GST-fusion proteins in phosphorylation studies.
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