FRET-enhanced photostability allows improved single-molecule tracking of proteins and protein complexes in live mammalian cells.
FRET-enhanced photostability allows improved single-molecule tracking of proteins and protein complexes in live mammalian cells.
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DOI：
10.1038/s41467-018-04486-0
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发表时间：
2018-06-28
影响因子：
16.6
通讯作者：
Laue ED
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Basu S;Needham LM;Lando D;Taylor EJR;Wohlfahrt KJ;Shah D;Boucher W;Tan YL;Bates LE;Tkachenko O;Cramard J;Lagerholm BC;Eggeling C;Hendrich B;Klenerman D;Lee SF;Laue ED
单分子成像的一个主要挑战是在活细胞中发现的密集环境中长时间跟踪蛋白质或复合物的动态。在这里，我们介绍了使用FRET的概念，以提高在这类研究中常用的光调制（PM）荧光团的光物理性质。通过开发新的单分子FRET对，由PM供体荧光团（mEos3.2或PA-JF549）和光稳定受体染料JF646旁边组成，我们证明FRET与正常的光漂白动力学途径竞争，以增加两个供体荧光团的光稳定性。使用三态淬灭器进一步增强了这种效果。我们的方法使我们能够显著改善活哺乳动物细胞中染色质结合蛋白的单分子跟踪。此外，它还提供了一种新的方法，通过标记一个蛋白质与PM供体及其与受体染料的相互作用伙伴来跟踪蛋白质复合物的定位和动力学。荧光团光漂白暂时限制了活细胞中荧光蛋白的单分子跟踪。在这里，作者展示了使用荧光团对，FRET与光漂白竞争，以提高光稳定性，并允许长期跟踪单个蛋白质和复合物。
A major challenge in single-molecule imaging is tracking the dynamics of proteins or complexes for long periods of time in the dense environments found in living cells. Here, we introduce the concept of using FRET to enhance the photophysical properties of photo-modulatable (PM) fluorophores commonly used in such studies. By developing novel single-molecule FRET pairs, consisting of a PM donor fluorophore (either mEos3.2 or PA-JF549) next to a photostable acceptor dye JF646, we demonstrate that FRET competes with normal photobleaching kinetic pathways to increase the photostability of both donor fluorophores. This effect was further enhanced using a triplet-state quencher. Our approach allows us to significantly improve single-molecule tracking of chromatin-binding proteins in live mammalian cells. In addition, it provides a novel way to track the localization and dynamics of protein complexes by labeling one protein with the PM donor and its interaction partner with the acceptor dye. Single molecule tracking of fluorescent proteins in live cells is temporally limited by fluorophore photobleaching. Here the authors show using fluorophore pairs that FRET competes with photobleaching to improve photostability and allow longer-term tracking of both single proteins and complexes.
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影响因子：
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作者：
Elf, Johan;Li, Gene-Wei;Xie, X. Sunney
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Xie, X. Sunney
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通讯作者：
Lavis, Luke D.
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作者：
Cordes, Thorben;Vogelsang, Jan;Tinnefeld, Philip
通讯作者：
Tinnefeld, Philip
DOI：
10.1007/978-1-4939-3631-1_17
发表时间：
2016-01-01
期刊：
Chromosome Architecture: Methods and Protocols
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--
作者：
Basu, Srinjan;Tan, Yi Lei;Lee, Steven F.
通讯作者：
Lee, Steven F.
影响因子：
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作者：
Ha T;Tinnefeld P
通讯作者：
Tinnefeld P