SNAP-, CLIP- and Halo-tag labelling of budding yeast cells.
SNAP-, CLIP- and Halo-tag labelling of budding yeast cells.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0078745
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发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Jakobs S
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Stagge F;Mitronova GY;Belov VN;Wurm CA;Jakobs S
荧光显微镜的定位和空间和时间动态的特异性标记的蛋白质是一个不可或缺的工具，在细胞生物学。除了作为标签的荧光蛋白之外，利用自标记蛋白作为SNAP-、CLIP-或Halo-标签的标签介导的标记被广泛使用，灵活的标记系统依赖于外源提供的荧光团。不幸的是，活芽殖酵母细胞的标记被证明是具有挑战性的这些方法，因为有限的细胞内部的染料的可及性。在这项研究中，我们开发了一种快速和可靠的电穿孔为基础的标签协议活芽殖酵母细胞表达SNAP，CLIP，或卤素标记的融合蛋白。对于Halo标签，我们证明了使用重要染料的6′-羧基异构体而不是5′-羧基异构体以确保细胞活力是至关重要的。本文提出了一个简单的规则，用于1H NMR谱的分析，以区分荧光素和罗丹明衍生物的6′-和5′-羧基异构体。我们证明了标记协议的可用性，通过成像酵母细胞与STED超分辨率显微镜和双色活细胞显微镜。这些自标记蛋白的大量可用荧光团和这里描述的协议的简单性扩展了模式生物酿酒酵母的可用工具箱。
Fluorescence microscopy of the localization and the spatial and temporal dynamics of specifically labelled proteins is an indispensable tool in cell biology. Besides fluorescent proteins as tags, tag-mediated labelling utilizing self-labelling proteins as the SNAP-, CLIP-, or the Halo-tag are widely used, flexible labelling systems relying on exogenously supplied fluorophores. Unfortunately, labelling of live budding yeast cells proved to be challenging with these approaches because of the limited accessibility of the cell interior to the dyes. In this study we developed a fast and reliable electroporation-based labelling protocol for living budding yeast cells expressing SNAP-, CLIP-, or Halo-tagged fusion proteins. For the Halo-tag, we demonstrate that it is crucial to use the 6′-carboxy isomers and not the 5′-carboxy isomers of important dyes to ensure cell viability. We report on a simple rule for the analysis of 1H NMR spectra to discriminate between 6′- and 5′-carboxy isomers of fluorescein and rhodamine derivatives. We demonstrate the usability of the labelling protocol by imaging yeast cells with STED super-resolution microscopy and dual colour live cell microscopy. The large number of available fluorophores for these self-labelling proteins and the simplicity of the protocol described here expands the available toolbox for the model organism Saccharomyces cerevisiae.
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