Development of nanoluciferase-based sensing system that can specifically detect 1α,25-dihydroxyvitamin D in living cells
Development of nanoluciferase-based sensing system that can specifically detect 1α,25-dihydroxyvitamin D in living cells
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开发基于纳米荧光素酶的传感系统，可特异性检测活细胞中的 1α,25-二羟基维生素 D
DOI：
10.1016/j.jsbmb.2022.106233
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发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Sakaki Toshiyuki
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Mano Hiroki;Kushioka Takuya;Kise Satoko;Nagao Chika;Iijima Ayano;Nishikawa Miyu;Ikushiro Shinichi;Yasuda Kaori;Matsuoka Sayuri;Sakaki Toshiyuki
在此之前，我们报道了一种FLucN-LXXLL+LBD-FLucC系统，该系统使用分裂萤火虫荧光素酶技术检测VDR配体、VDR的配体结合结构域（LBD）以及在VDR配体结合后与LBD相互作用的LXXLL序列。因此，25（OH）D3和1α，25（OH）2D 3的含量是佝偻病和骨质疏松症等骨相关疾病的指标。在这项研究中，我们开发了一种新的LgBiT-LXXLL+LBD-SmBiT系统使用NanoLuc二元技术（NanoBiT），它具有几倍的发射强度比分裂型萤火虫荧光素酶。此外，我们还尝试利用基因工程技术构建了一种能够特异性检测1α，25（OH）2D 3的新体系。由于305和397位的组氨酸残基在与25（OH）D3和1α，25（OH）2D 3的C25位的羟基形成氢键中起重要作用，因此His 305和His 397各自被其它氨基酸取代。因此，3个突变的VDR，H305 D，H397 N和H397 E是同样有用的检测1α，25（OH）2D 3特异性。此外，在LXXLL序列的58个变体中，LPYEGSLLLKLLRAPVEE在加入25（OH）D3或1α，25（OH）2D 3后显示出最大的发光增加。因此，我们使用NanoBiT的新系统似乎可用于检测天然维生素D或其衍生物。
Previously, we reported a FLucN-LXXLL+LBD-FLucC system that detects VDR ligands using split firefly luciferase techniques, ligand binding domain (LBD) of VDR, and LXXLL sequences that interact with LBD after VDR ligand binding.In vivo, 25-hydroxyvitamin D3(25(OH)D3) and 1α,25-dihydroxyvitamin D3(1α,25(OH)2D3) act as VDR ligands that bind to VDR, and regulate bone-related gene expression. Therefore, the amount of 25(OH)D3and 1α,25(OH)2D3are indicators of bone-related diseases such as rickets and osteoporosis. In this study, we have developed a novel LgBiT-LXXLL+LBD-SmBiT system using NanoLuc Binary Technology (NanoBiT), which has an emission intensity several times higher than that of the split-type firefly luciferase. Furthermore, by using genetic engineering techniques, we attempted to construct a novel system that can specifically detect 1α,25(OH)2D3. Because histidine residues at positions 305 and 397 play important roles in forming a hydrogen bond with a hydroxyl group at position C25 of 25(OH)D3and 1α,25(OH)2D3, His305 and His397 were each substituted by other amino acids. Consequently, the three mutant VDRs, H305D, H397N, and H397E were equally useful to detect 1α,25(OH)2D3specifically. In addition, among the 58 variants of the LXXLL sequences, LPYEGSLLLKLLRAPVEE showed the greatest increase in luminescence upon the addition of 25(OH)D3or 1α,25(OH)2D3. Thus, our novel system using NanoBiT appear to be useful for detecting native vitamin D or its derivatives.
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