Evaluation of stable reference genes for qPCR normalization in circadian studies related to lung inflammation and injury in mouse model.
Evaluation of stable reference genes for qPCR normalization in circadian studies related to lung inflammation and injury in mouse model.
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DOI：
10.1038/s41598-022-05836-1
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发表时间：
2022-02-02
影响因子：
4.6
通讯作者：
Sundar IK
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Giri A;Sundar IK
昼夜节律对慢性气道疾病的肺功能和免疫炎症反应有深远的影响。因此，了解核心时钟控制基因（CCG）的昼夜节律基因表达的分子机制可能有助于更好地了解它如何有助于肺部疾病的生理和病理。正在进行的研究已经使用定量实时PCR（qRT-PCR）分析小鼠肺中CCG的基因表达水平。然而，到目前为止，还没有关于小鼠肺中最稳定的参考基因用于昼夜节律研究的报道。在本文中，我们利用急性屋尘螨（HDM）致敏小鼠模型，使用5种独特的算法（GeNorm、Normalization、BestKeeper、Refmalization和Qbase+）来评估通常用于qRT-PCR标准化的10个参考基因的稳定性。在所有评价的样品中，Rn 18 s被确定为最稳定的参考基因，Actb被确定为最不稳定的参考基因。此外，CircWave分析显示Rn 18 s的表达模式没有昼夜变化，但Actb在PBS（对照）和HDM组的肺中显示强烈的昼夜变化。我们系统地证明了使用Actb作为管家基因如何抵消CCG的昼夜表达模式，并导致统计学上显著的结果，这可能不是qRT-PCR分析的真实反映。
Circadian rhythms have a profound effect on lung function and immune-inflammatory response in chronic airway diseases. Thus, understanding the molecular mechanisms of circadian gene expression of core clock-controlled genes (CCGs) may help better understand how it contributes to the physiology and pathology of lung diseases. Ongoing studies have been analyzing gene expression levels of CCGs in mouse lungs using quantitative real-time PCR (qRT-PCR). However, to date, there are no reports on the most stable reference gene in the mouse lung for circadian studies. Herein, we utilized an acute house dust mite (HDM)-sensitization mouse model to evaluate the stability of 10 reference genes commonly used for qRT-PCR normalization using 5 unique algorithms: GeNorm, NormFinder, BestKeeper, RefFinder and Qbase+. Rn18s was determined as the most stable reference gene across all samples evaluated, and Actb, the least stable reference gene. Furthermore, CircWave analysis showed no diurnal variation in the expression pattern for Rn18s but Actb showed strong diurnal changes in the lungs of both PBS (control) and HDM groups. We demonstrate systematically how using Actb as a housekeeping gene offsets the diurnal expression patterns of the CCGs and leads to statistically significant results which may not be the true reflection of the qRT-PCR analysis.
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