ShadowY: a dark yellow fluorescent protein for FLIM-based FRET measurement.
ShadowY: a dark yellow fluorescent protein for FLIM-based FRET measurement.
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DOI：
10.1038/s41598-017-07002-4
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发表时间：
2017-07-28
影响因子：
4.6
通讯作者：
Shibata ACE
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Murakoshi H;Shibata ACE
基于荧光寿命成像显微镜（FLIM）的Förster共振能量转移（FRET）测量（FLIM-FRET）是用于成像细胞内蛋白质活性（例如蛋白质-蛋白质相互作用和构象变化）的有力方法之一。在这里，使用饱和诱变，我们开发了一种暗黄色荧光蛋白命名为ShadowY，可以作为FLIM-FRET受体。ShadowY在光谱上类似于先前报道的暗YFP，但具有小得多的量子产率、大的消光系数和优越的上级折叠性质。当ShadowY与mEGFP或三叶草突变体（CloverT 153 M/F223 R）配对并应用于单分子FRET传感器以监测HeLa细胞中光氧电压结构域2（LOV 2）的光依赖性构象变化时，我们观察到大的FRET信号变化，具有低的细胞间变异性，允许精确测量个体细胞反应。此外，应用ShadowY分离型Ras FRET传感器揭示了EGF依赖的大FRET信号增加。因此，ShadowY与mEGFP或CloverT 153 M/F223 R的组合是有希望的FLIM-FRET受体。
Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM)-based Förster resonance energy transfer (FRET) measurement (FLIM-FRET) is one of the powerful methods for imaging of intracellular protein activities such as protein–protein interactions and conformational changes. Here, using saturation mutagenesis, we developed a dark yellow fluorescent protein named ShadowY that can serve as an acceptor for FLIM-FRET. ShadowY is spectrally similar to the previously reported dark YFP but has a much smaller quantum yield, greater extinction coefficient, and superior folding property. When ShadowY was paired with mEGFP or a Clover mutant (CloverT153M/F223R) and applied to a single-molecule FRET sensor to monitor a light-dependent conformational change of the light-oxygen-voltage domain 2 (LOV2) in HeLa cells, we observed a large FRET signal change with low cell-to-cell variability, allowing for precise measurement of individual cell responses. In addition, an application of ShadowY to a separate-type Ras FRET sensor revealed an EGF-dependent large FRET signal increase. Thus, ShadowY in combination with mEGFP or CloverT153M/F223R is a promising FLIM-FRET acceptor.
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