Detection of ligand-induced CNTF receptor dimers in living cells by fluorescence cross correlation spectroscopy.
Detection of ligand-induced CNTF receptor dimers in living cells by fluorescence cross correlation spectroscopy.
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通过荧光互相关光谱检测活细胞中配体诱导的 CNTF 受体二聚体。
DOI：
10.1016/j.bbamem.2009.05.013
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发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
L. Graeve
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Felix Neugart;Andrea Zappe;Deborah M. Buk;I. Ziegler;S. Steinert;Monika Schumacher;Eva Schopf;Ralph Bessey;K. Wurster;C. Tietz;M. Börsch;J. Wrachtrup;L. Graeve
睫状神经营养因子（CNTF）通过由特异性CNTF受体（CNTFR）和两个混杂信号转导子gp 130和白血病抑制因子受体（LIFR）组成的受体复合物来传递信号。虽然早期的研究表明信号复合物是一个六聚体，但最近的分析强烈支持四聚体结构。然而，迄今为止，所有的研究分析的CNTF受体复合物的化学计量在体外，而不是在活细胞的情况下。我们在哺乳动物细胞中产生并表达了CNTF和CNTFR的酰基载体蛋白标记版本。用不同的染料标记CNTF和CNTFR后，我们分析了它们在细胞表面的扩散行为。荧光（交叉）相关光谱（FCS/FCCS）测量显示CNTFR的扩散常数约为2×10− 9 cm 2 s − 1，与CNTF是否结合无关。FCS和FCCS测量检测含有至少两个CNTF和CNTFR的受体复合物的形成。此外，我们测量了受体复合物内两个不同标记的CNTF之间的Förster型荧光共振能量转移，表明两者之间的距离为5-7 nm。这些发现与CNTFR复合物的四聚体结构不一致，这表明形成了六聚体和/或甚至更高阶的结构（例如含有两个四聚体的八聚体）。
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) signals via a receptor complex consisting of the specific CNTF receptor (CNTFR) and two promiscuous signal transducers, gp130 and leukemia inhibitory factor receptor (LIFR). Whereas earlier studies suggested that the signaling complex is a hexamer, more recent analyses strongly support a tetrameric structure. However, all studies so far analyzed the stoichiometry of the CNTF receptor complex in vitro and not in the context of living cells. We generated and expressed in mammalian cells acyl carrier protein-tagged versions of both CNTF and CNTFR. After labeling CNTF and CNTFR with different dyes we analyzed their diffusion behavior at the cell surface. Fluorescence (cross) correlation spectroscopy (FCS/FCCS) measurements reveal that CNTFR diffuses with a diffusion constant of about 2×10−9cm2s−1independent of whether CNTF is bound or not. FCS and FCCS measurements detect the formation of receptor complexes containing at least two CNTFs and CNTFRs. In addition, we measured Förster-type fluorescence resonance energy transfer between two differently labeled CNTFs within a receptor complex indicating a distance of 5–7 nm between the two. These findings are not consistent with a tetrameric structure of the CNTFR complex suggesting that either hexamers and or even higher-order structures (e.g. an octamer containing two tetramers) are formed.
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