Virtual-'light-sheet' single-molecule localisation microscopy enables quantitative optical sectioning for super-resolution imaging.
Virtual-'light-sheet' single-molecule localisation microscopy enables quantitative optical sectioning for super-resolution imaging.
复制标题
DOI：
10.1371/journal.pone.0125438
复制
发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Lee SF
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Palayret M;Armes H;Basu S;Watson AT;Herbert A;Lando D;Etheridge TJ;Endesfelder U;Heilemann M;Laue E;Carr AM;Klenerman D;Lee SF
单分子超分辨率显微镜允许活细胞中荧光标记蛋白质的成像，其精度远低于衍射极限。在这里，我们演示了3D切片与单分子超分辨率显微镜，通过利用拟合信息，通常被丢弃，以拒绝从上方或下方发出的虚拟“光片”，薄体积集中在显微镜的焦平面上的荧光团。我们描述了一个易于使用的例程（作为开源ImageJ插件实现），以快速分析校准样品，定义和使用这样的虚拟光片。此外，该插件可以在几乎所有现有的2D超分辨率仪器上轻松使用。这种超分辨率图像的光学切片是通过将良好表征的宽度和幅度阈值应用于衍射限制点来实现的，所述衍射限制点可用于调整虚拟光片的厚度。这允许定性和定量成像的改进：通过拒绝焦点外的荧光团，超分辨率图像获得对比度和局部特征可以被揭示;通过仅保留靠近焦平面的荧光团，虚拟“光片”单分子定位显微镜提高了所有发射荧光团将被检测，拟合和定量评估的概率。
Single-molecule super-resolution microscopy allows imaging of fluorescently-tagged proteins in live cells with a precision well below that of the diffraction limit. Here, we demonstrate 3D sectioning with single-molecule super-resolution microscopy by making use of the fitting information that is usually discarded to reject fluorophores that emit from above or below a virtual-'light-sheet', a thin volume centred on the focal plane of the microscope. We describe an easy-to-use routine (implemented as an open-source ImageJ plug-in) to quickly analyse a calibration sample to define and use such a virtual light-sheet. In addition, the plug-in is easily usable on almost any existing 2D super-resolution instrumentation. This optical sectioning of super-resolution images is achieved by applying well-characterised width and amplitude thresholds to diffraction-limited spots that can be used to tune the thickness of the virtual light-sheet. This allows qualitative and quantitative imaging improvements: by rejecting out-of-focus fluorophores, the super-resolution image gains contrast and local features may be revealed; by retaining only fluorophores close to the focal plane, virtual-'light-sheet' single-molecule localisation microscopy improves the probability that all emitting fluorophores will be detected, fitted and quantitatively evaluated.
登录
查看更多内容
影响因子：
9.2
作者：
Bone, N;Millar, JBA;Armstrong, J
通讯作者：
Armstrong, J
DOI：
10.1073/pnas.0900245106
发表时间：
2009-03-03
影响因子：
11.1
作者：
Pavani, Sri Rama Prasanna;Thompson, Michael A.;Moerner, W. E.
通讯作者：
Moerner, W. E.
影响因子：
48
作者：
Rust, Michael J.;Bates, Mark;Zhuang, Xiaowei
通讯作者：
Zhuang, Xiaowei
影响因子：
5.8
作者：
Lando D;Endesfelder U;Berger H;Subramanian L;Dunne PD;McColl J;Klenerman D;Carr AM;Sauer M;Allshire RC;Heilemann M;Laue ED
通讯作者：
Laue ED
影响因子：
48
作者：
Juette, Manuel F.;Gould, Travis J.;Bewersdorf, Joerg
通讯作者：
Bewersdorf, Joerg