Multiplexed CRISPR-Cas9 system in a single adeno-associated virus to simultaneously knock out redundant clock genes.
Multiplexed CRISPR-Cas9 system in a single adeno-associated virus to simultaneously knock out redundant clock genes.
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DOI：
10.1038/s41598-021-82287-0
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发表时间：
2021-01-28
影响因子：
4.6
通讯作者：
Choe HK
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kim B;Kim J;Chun M;Park I;Kwak D;Choi M;Kim K;Choe HK
哺乳动物的分子钟是基于转录-翻译反馈环（TTFL），包括Period 1，2（Per 1，2），Cryptochrome 1，2（Cry 1，2）和脑和肌肉ARNT样1（Bmal 1）基因。TTFL的鲁棒性归因于一些必需的时钟基因之间的遗传冗余，阻碍了使用针对单个基因的基因组编辑对分子时钟进行遗传研究。为了以简化和有效的方式操纵多个时钟基因，我们开发了一种基于CRISPR-Cas9的单一腺相关病毒（AAV）系统，该系统靶向生物钟（CSAC），用于必需的时钟基因，包括Pers，Crys或Bmal 1。首先，我们在计算机上测试了几种靶向单个时钟基因的单向导RNA（sgRNA），并验证了它们在Neuro 2a细胞中的效率。为了靶向多个基因，使用Golden Gate组装构建多重sgRNA质粒并包装到AAV中。CSAC效率通过体外蛋白质下调和离体消除分子振荡而明显。我们还通过在将CSAC注射到表达Cas9的敲入小鼠的视交叉上核中之后评估昼夜节律来测量CSAC的体内效率。在这些小鼠中，昼夜运动活动和体温节律被严重破坏，这表明我们的CSAC是研究体内分子钟的简单而强大的工具。
The mammalian molecular clock is based on a transcription-translation feedback loop (TTFL) comprising the Period1, 2 (Per1, 2), Cryptochrome1, 2 (Cry1, 2), and Brain and Muscle ARNT-Like 1 (Bmal1) genes. The robustness of the TTFL is attributed to genetic redundancy among some essential clock genes, deterring genetic studies on molecular clocks using genome editing targeting single genes. To manipulate multiple clock genes in a streamlined and efficient manner, we developed a CRISPR-Cas9-based single adeno-associated viral (AAV) system targeting the circadian clock (CSAC) for essential clock genes including Pers, Crys, or Bmal1. First, we tested several single guide RNAs (sgRNAs) targeting individual clock genes in silico and validated their efficiency in Neuro2a cells. To target multiple genes, multiplex sgRNA plasmids were constructed using Golden Gate assembly and packaged into AAVs. CSAC efficiency was evident through protein downregulation in vitro and ablated molecular oscillation ex vivo. We also measured the efficiency of CSAC in vivo by assessing circadian rhythms after injecting CSAC into the suprachiasmatic nuclei of Cas9-expressing knock-in mice. Circadian locomotor activity and body temperature rhythms were severely disrupted in these mice, indicating that our CSAC is a simple yet powerful tool for investigating the molecular clock in vivo.
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影响因子：
20.6
作者：
Liu Z;Cai Y;Liao Z;Xu Y;Wang Y;Wang Z;Jiang X;Li Y;Lu Y;Nie Y;Zhang X;Li C;Bian X;Poo MM;Chang HC;Sun Q
通讯作者：
Sun Q
DOI：
10.1152/ajpregu.00395.2004
发表时间：
2005-01-01
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通讯作者：
Kanosue, K
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