Engineered dual selection for directed evolution of SpCas9 PAM specificity.
Engineered dual selection for directed evolution of SpCas9 PAM specificity.
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用于SpCas9 PAM特异性的定向进化的工程化双重选择。
DOI：
10.1038/s41467-020-20650-x
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发表时间：
2021-01-13
影响因子：
16.6
通讯作者：
Noyes MB
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Goldberg GW;Spencer JM;Giganti DO;Camellato BR;Agmon N;Ichikawa DM;Boeke JD;Noyes MB
广泛使用的酿脓链球菌Cas9（SpCas 9）核酸酶除了其向导RNA和靶DNA之间的碱基配对相互作用之外，还从与前间隔区邻近基序（PAM）序列的蛋白质-DNA接触获得其DNA靶向特异性。先前的报道已经确定，SpCas 9的PAM特异性可以通过用于定向进化或其他蛋白质工程化策略的正选择程序来改变。在这里，我们利用体内定向进化系统，其结合同时的阳性和阴性选择以进化SpCas 9变体，其相对于野生型对NAG PAM具有相当的或改善的活性，并且对NGG PAM，特别是YGG PAM具有降低的活性。我们还表明，可用的进化中间体的PAM偏好有效地确定了类似的反选择PAM是否引起不同的选择严格性，并证明了通过补偿性锌指与SpCas 9的融合，可以在酵母选择系统中特异性地增加负选择。SpCas 9的PAM特异性可以在定向进化期间用正选择改变。在这里，作者使用同时的阳性和阴性选择来提高对NAG PAM的活性，同时降低对NGG PAM的活性。
The widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) nuclease derives its DNA targeting specificity from protein-DNA contacts with protospacer adjacent motif (PAM) sequences, in addition to base-pairing interactions between its guide RNA and target DNA. Previous reports have established that the PAM specificity of SpCas9 can be altered via positive selection procedures for directed evolution or other protein engineering strategies. Here we exploit in vivo directed evolution systems that incorporate simultaneous positive and negative selection to evolve SpCas9 variants with commensurate or improved activity on NAG PAMs relative to wild type and reduced activity on NGG PAMs, particularly YGG PAMs. We also show that the PAM preferences of available evolutionary intermediates effectively determine whether similar counterselection PAMs elicit different selection stringencies, and demonstrate that negative selection can be specifically increased in a yeast selection system through the fusion of compensatory zinc fingers to SpCas9. The PAM specificity of SpCas9 can be altered with positive selection during directed evolution. Here the authors use simultaneous positive and negative selection to improve activity on NAG PAMs while reducing activity on NGG PAMs.
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影响因子：
46.9
作者：
Doench JG;Fusi N;Sullender M;Hegde M;Vaimberg EW;Donovan KF;Smith I;Tothova Z;Wilen C;Orchard R;Virgin HW;Listgarten J;Root DE
通讯作者：
Root DE
影响因子：
64.8
作者：
Anders, Carolin;Niewoehner, Ole;Duerst, Alessia;Jinek, Martin
通讯作者：
Jinek, Martin
DOI：
10.1007/978-1-4939-1363-3_1
发表时间：
2014-01-01
期刊：
YEAST GENETICS: METHODS AND PROTOCOLS
影响因子：
--
作者：
Gietz, R. Daniel
通讯作者：
Gietz, R. Daniel
影响因子：
3.2
作者：
Deveau, Helene;Barrangou, Rodolphe;Moineau, Sylvain
通讯作者：
Moineau, Sylvain
影响因子：
14.8
作者：
Carlson, Jacob C.;Badran, Ahmed H.;Guggiana-Nilo, Drago A.;Liu, David R.
通讯作者：
Liu, David R.