Identification of a splicing enhancer in MLH1 using COMPARE, a new assay for determination of relative RNA splicing efficiencies.
Identification of a splicing enhancer in MLH1 using COMPARE, a new assay for determination of relative RNA splicing efficiencies.
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使用 COMPARE 鉴定 MLH1 中的剪接增强子，COMPARE 是一种确定相对 RNA 剪接效率的新测定方法。
DOI：
10.1093/hmg/ddi450
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发表时间：
2006
影响因子：
3.5
通讯作者：
Mattox,William
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Xu,Dong-Qing;Mattox,William
外显子剪接增强子（ESE）是促进剪接位点识别并防止外显子跳跃的序列。由于 ESE 通常嵌入蛋白质编码序列中，因此它们的改变通常也可以被解释为无义、错义或沉默突变。为了正确解释外显子突变及其在疾病中的作用，制定识别 ESE 突变的策略非常重要。可以通过计算在许多外显子中找到潜在的 ESE，但事实证明很难仅根据序列来预测给定的突变是否会对剪接产生影响。在这里，我们描述了一种灵活的体外方法，可用于在单个体外剪接反应中功能性比较多个序列变体对 ESE 活性的影响。我们将此方法与传统剪接测定并行应用，以测试人类 MLH1 基因外显子 17 中的剪接增强子。此前已发现与遗传性非息肉病性结直肠癌 (HNPCC) 相关的点突变与患者淋巴细胞和肿瘤中的外显子跳跃相关。我们证明，来自该外显子的序列可以取代小鼠 IgM 基因的 ESE，以支持 HeLa 核提取物中的 RNA 剪接。 ESE 活性因密码子 659 中的 HNPCC 点突变而降低，表明它们的主要作用是剪接。令人惊讶的是，最强的增强子功能映射到该密码子上游外显子的不同区域。总之，我们的结果表明密码子 659 中的 HNPCC 点突变会影响辅助元件，从而增强增强子功能以确保外显子包含。
Exonic splicing enhancers (ESEs) are sequences that facilitate recognition of splice sites and prevent exon-skipping. Because ESEs are often embedded within protein-coding sequences, alterations in them can also often be interpreted as nonsense, missense or silent mutations. To correctly interpret exonic mutations and their roles in diseases, it is important to develop strategies that identify ESE mutations. Potential ESEs can be found computationally in many exons but it has proven difficult to predict whether a given mutation will have effects on splicing based on sequence alone. Here, we describe a flexiblein vitromethod that can be used to functionally compare the effects of multiple sequence variants on ESE activity in a singlein vitrosplicing reaction. We have applied this method in parallel with conventional splicing assays to test for a splicing enhancer in exon 17 of the humanMLH1gene. Point mutations associated with hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) have previously been found to correlate with exon-skipping in both lymphocytes and tumors from patients. We show that sequences from this exon can replace an ESE from the mouse IgM gene to support RNA splicing in HeLa nuclear extracts. ESE activity was reduced by HNPCC point mutations in codon 659, indicating that their primary effect is on splicing. Surprisingly, the strongest enhancer function mapped to a different region of the exon upstream of this codon. Together, our results indicate that HNPCC point mutations in codon 659 affect an auxillary element that augments the enhancer function to ensure exon inclusion.
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