FRET study of the structural and kinetic effects of PKC phosphomimetic cardiac troponin T mutants on thin filament regulation.
FRET study of the structural and kinetic effects of PKC phosphomimetic cardiac troponin T mutants on thin filament regulation.
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FRET 研究 PKC 磷酸模拟心肌肌钙蛋白 T 突变体对细丝调节的结构和动力学影响。
DOI：
10.1016/j.abb.2014.03.013
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发表时间：
2014
影响因子：
3.9
通讯作者：
Dong,Wen-Ji
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Schlecht,William;Zhou,Zhiqun;Li,King-Lun;Rieck,Daniel;Ouyang,Yexin;Dong,Wen-Ji
FRET被用来调查的结构和动力学的影响，PKC磷酸化施加对Ca 2+和肌球蛋白亚片段1依赖的心脏细丝的构象转换。通过谷氨酸取代模拟cTnT的PKC磷酸化。Ca 2+和S1-诱导的cTnC和cTnI的开关区（cTnI-Sr）之间的中央连接器的距离变化进行了监测，在重建的细丝使用稳态和时间分辨FRET，而结构转变的动力学确定使用停止流。发现cTnT（T204 E）突变体的存在显著减弱了细丝Ca 2+敏感性，而在其他位点的假磷酸化增加了Ca 2+敏感性。在假磷酸化的存在下，cTnI-Sr的C-末端的Ca 2+解离诱导的结构变化的速率降低，而在该区域的N-末端保持不变。此外，对于三重和四重磷酸化模拟突变体cTnT（T195 E/S199 E/T204 E）和cTnT（T195 E/S199 E/T204 E/T285 E），cTnI-Sr和cTnC之间的距离显著减小，这与在这些相同突变体中观察到的Ca 2+敏感性增加相关。我们的结论是显着的变化，细丝Ca 2+敏感性，结构和动力学所带来的通过PKC磷酸化cTnT。这些变化可以降低或增加Ca 2+敏感性，并可能在心脏调节中发挥重要作用。
FRET was used to investigate the structural and kinetic effects that PKC phosphorylations exert on Ca2+and myosin subfragment-1 dependent conformational transitions of the cardiac thin filament. PKC phosphorylations of cTnT were mimicked by glutamate substitution. Ca2+and S1-induced distance changes between the central linker of cTnC and the switch region of cTnI (cTnI-Sr) were monitored in reconstituted thin filaments using steady state and time resolved FRET, while kinetics of structural transitions were determined using stopped flow. Thin filament Ca2+sensitivity was found to be significantly blunted by the presence of the cTnT(T204E) mutant, whereas pseudo-phosphorylation at additional sites increased the Ca2+-sensitivity. The rate of Ca2+-dissociation induced structural changes was decreased in the C-terminal end of cTnI-Sr in the presence of pseudo-phosphorylations while remaining unchanged at the N-terminal end of this region. Additionally, the distance between cTnI-Sr and cTnC was decreased significantly for the triple and quadruple phosphomimetic mutants cTnT(T195E/S199E/T204E) and cTnT(T195E/S199E/T204E/T285E), which correlated with the Ca2+-sensitivity increase seen in these same mutants. We conclude that significant changes in thin filament Ca2+-sensitivity, structure and kinetics are brought about through PKC phosphorylation of cTnT. These changes can either decrease or increase Ca2+-sensitivity and likely play an important role in cardiac regulation.
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