Crystal structure of the Escherichia coli Tas protein, an NADP(H)-dependent aldo-keto reductase.
Crystal structure of the Escherichia coli Tas protein, an NADP(H)-dependent aldo-keto reductase.
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大肠杆菌 Tas 蛋白的晶体结构，一种 NADP(H) 依赖性醛酮还原酶。
DOI：
10.1002/prot.10367
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发表时间：
2003
期刊：
影响因子：
2.9
通讯作者：
Gilliland,GaryL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Obmolova,Galina;Teplyakov,Alexey;Khil,PavelP;Howard,AndrewJ;Camerini-Otero,RDaniel;Gilliland,GaryL
材料和方法克隆、表达和纯化。从大肠杆菌MG1655基因组DNA中扩增出Tas基因，利用Gateway技术(Invitgen)将其亚克隆到pDONR201载体上。通过定点重组(Invitgen)将编码序列转移到pDEST14载体中进行表达。用pDEST14转化大肠杆菌BL21 Star(DE3)(Invitgen)，表达该蛋白。细胞生长在含100g/L氨基青霉素的LB培养基上，37℃，A600为0.6，1 mM异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导3h，用Source30Q(Pharmacia)和Butyl-560M(Toyota Opearl)柱层析分两步纯化。缩写：NADPH，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；TIM，磷酸丙糖异构酶；KVB2，电压依赖性K通道亚基；RMSD，均方根差；PCR，聚合酶链式反应；IMCA-CAT，工业大分子晶体协作访问小组；APS，高级光子源；电荷耦合装置。
Materials and Methods. Cloning, expression, and purification. The Tas gene was polymerase chain reaction (PCR) amplified from E. coli MG1655 genomic DNA and subcloned into a pDONR201 plasmid using the Gateway technology (Invitrogen). For expression, the coding sequence was transferred into a pDEST14 plasmid using site-specific recombination (Invitrogen). The protein was produced in E. coli strain BL21 Star (DE3)(Invitrogen) that was transformed with pDEST14. Cells were grown on LB media containing 100 g/L ampicillin at 37 C to an A600 of 0.6 and induced with 1 mM isopropyl-D-thiogalactoside for 3 h. The protein was purified by column chromatography in two steps using Source 30Q (Pharmacia) and Butyl-560M (Toyopearl).Abbreviations: NADPH, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; TIM, triosephosphate isomerase; KVB2, voltage-dependent K channel subunit; RMSD, root mean square deviation; PCR, polymerase chain reaction; IMCA-CAT, Industrial Macromolecular Crystallography Collaborative Access Team; APS, Advanced Photon Source; CCD, charge-coupled device.
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