Selective monitoring of ubiquitin signals with genetically encoded ubiquitin chain–specific sensors
Selective monitoring of ubiquitin signals with genetically encoded ubiquitin chain–specific sensors
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使用基因编码的泛素链特异性传感器选择性监测泛素信号
DOI：
10.1038/nprot.2013.089
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发表时间：
2013
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
I. Dikič
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
S. V. Wijk;Evgenij Fiskin;I. Dikič
尽管深入的研究，有一个显着缺乏的方法可视化内源性泛素化在活细胞。在这个协议中，我们描述了如何独特的特性的泛素（Ub）结合结构域（UBD）可以用来选择性地检测，可视化和抑制哺乳动物细胞中的Ub依赖的过程。该程序涉及设计和验证GFP标记的K63和线性连接的传感器（分别为TAB 2 NZF和NEMO UBAN）在体外的结合选择性。我们描述了这些部分如何可用于抑制肿瘤坏死因子（TNF）介导的NF-κB信号转导和检测活细胞中的泛素化胞质沙门氏菌，强调了更灵活的使用相比，链特异性抗体。这些链特异性传感器可用于检测Ub样或自噬相关的修饰剂，并与质谱法相结合，以识别新的Ub靶点。这些Ub（类）传感器可以在12 -3周内设计、构建和测试。
Despite intensive research, there is a distinct lack of methodology for visualizing endogenous ubiquitination in living cells. In this protocol, we describe how unique properties of ubiquitin (Ub)-binding domains (UBDs) can be used to selectively detect, visualize and inhibit Ub-dependent processes in mammalian cells. The procedure deals with designing and validating the binding selectivity of GFP-tagged K63- and linear-linked sensors (TAB2 NZF and NEMO UBAN, respectively) in vitro. We describe how these moieties can be used to inhibit tumor necrosis factor (TNF)-mediated NF-κB signaling and to detect ubiquitinated cytosolic Salmonella in living cells, emphasizing a more flexible use compared with chain-specific antibodies. These chain-specific sensors can be used to detect Ub-like or autophagy-related modifiers and, in combination with mass spectrometry, to identify new Ub targets. These Ub (-like) sensors can be designed, constructed and tested in ∼2–3 weeks.
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