Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code.
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DOI：
10.1093/nar/gku1087
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发表时间：
2015-01
影响因子：
14.9
通讯作者：
Rinehart J
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Aerni HR;Shifman MA;Rogulina S;O'Donoghue P;Rinehart J
可以操纵遗传密码来重新分配密码子，以掺入非标准氨基酸 (NSAA)。大肠杆菌中释放因子 1 的缺失增强了 UAG（终止）密码子的翻译，但也可能延长了天然 UAG 终止信使 RNA 的蛋白质合成。重新分配的 UAG 密码子上蛋白质合成的保真度以及所产生的含有 NSAA 的蛋白质的纯度需要仔细检查。蛋白质组学将是完成这些任务的理想工具，但传统的蛋白质组学分析无法轻松识别延伸蛋白质并准确发现单个 UAG 处的多个氨基酸 (AA) 插入。为了应对这些挑战，我们创建了一个新的蛋白质组工作流程，能够检测大肠杆菌菌株天然蛋白质中的 UAG 通读，其中 UAG 被重新分配为编码磷酸丝氨酸。该方法还能够对重组报告蛋白中 UAG 中掺入的 NSAA 和天然 AA 进行定量。作为原理验证，我们测量了磷酸丝氨酸正交翻译系统 (OTS) 的保真度和纯度，并利用该信息来提高其性能。我们的结果显示，重新分配的终止密码子处的天然 AA 具有惊人的多样性。我们的方法可用于改进 OTS 并量化具有扩展遗传密码的生物体中重新分配的密码子的氨基酸纯度。
The genetic code can be manipulated to reassign codons for the incorporation of non-standard amino acids (NSAA). Deletion of release factor 1 in Escherichia coli enhances translation of UAG (Stop) codons, yet may also extended protein synthesis at natural UAG terminated messenger RNAs. The fidelity of protein synthesis at reassigned UAG codons and the purity of the NSAA containing proteins produced require careful examination. Proteomics would be an ideal tool for these tasks, but conventional proteomic analyses cannot readily identify the extended proteins and accurately discover multiple amino acid (AA) insertions at a single UAG. To address these challenges, we created a new proteomic workflow that enabled the detection of UAG readthrough in native proteins in E. coli strains in which UAG was reassigned to encode phosphoserine. The method also enabled quantitation of NSAA and natural AA incorporation at UAG in a recombinant reporter protein. As a proof-of-principle, we measured the fidelity and purity of the phosphoserine orthogonal translation system (OTS) and used this information to improve its performance. Our results show a surprising diversity of natural AAs at reassigned stop codons. Our method can be used to improve OTSs and to quantify amino acid purity at reassigned codons in organisms with expanded genetic codes.
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