In Vitro Nanobody Library Construction by Using Gene Designated-Region Pan-Editing Technology.
In Vitro Nanobody Library Construction by Using Gene Designated-Region Pan-Editing Technology.
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利用基因指定区域泛编辑技术构建体外纳米抗体文库
DOI：
10.34133/2022/9823578
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发表时间：
2022
影响因子：
--
通讯作者：
Zhu W
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Niu Z;Luo Z;Sun P;Ning L;Jin X;Chen G;Guo C;Zhi L;Chang W;Zhu W
骆驼科动物单域抗体片段（纳米抗体）是近年来治疗性生物药物和临床诊断试剂中的一支新兴力量。迄今为止，几乎所有的纳米抗体都是通过动物免疫获得的，这是限制纳米抗体大规模应用的瓶颈。在这项研究中，我们开发了三种基因指定区域泛编辑（GDP）技术，在体外纳米抗体的互补决定区（CDR）中引入多个突变。包括在CDR中整合G-四链体片段，其诱导CDR中的自发多突变;然而，这些突变序列高度相似，导致CDR中缺乏序列多样性。我们还使用了靶向CDR的传统gRNA指导的碱基编辑器，其有效地使CDR多样化。最重要的是，我们开发了自组装gRNA，它是通过将内源性mRNA重编程为tracrRNA劫持为crRNA而产生的。使用由自组装gRNA引导的碱基编辑器，我们可以实现CDR的迭代多样化。我们认为，最后一种GDP技术在构建免免疫纳米抗体库方面具有很大的应用前景，这种新型纳米抗体发现平台的充分发展可以实现纳米抗体的体外合成进化。
Camelid single-domain antibody fragments (nanobodies) are an emerging force in therapeutic biopharmaceuticals and clinical diagnostic reagents in recent years. Nearly all nanobodies available to date have been obtained by animal immunization, a bottleneck restricting the large-scale application of nanobodies. In this study, we developed three kinds of gene designated-region pan-editing (GDP) technologies to introduce multiple mutations in complementarity-determining regions (CDRs) of nanobodies in vitro. Including the integration of G-quadruplex fragments in CDRs, which induces the spontaneous multiple mutations in CDRs; however, these mutant sequences are highly similar, resulting in a lack of sequences diversity in the CDRs. We also used CDR-targeting traditional gRNA-guided base-editors, which effectively diversify the CDRs. And most importantly, we developed the self-assembling gRNAs, which are generated by reprogrammed tracrRNA hijacking of endogenous mRNAs as crRNAs. Using base-editors guided by self-assembling gRNAs, we can realize the iteratively diversify the CDRs. And we believe the last GDP technology is highly promising in immunization-free nanobody library construction, and the full development of this novel nanobody discovery platform can realize the synthetic evolution of nanobodies in vitro.
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