A genetic screen for components of the mammalian RNA interference pathway in Bloom-deficient mouse embryonic stem cells.
A genetic screen for components of the mammalian RNA interference pathway in Bloom-deficient mouse embryonic stem cells.
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DOI：
10.1093/nar/gkp019
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发表时间：
2009-03
影响因子：
14.9
通讯作者：
Wang X
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Trombly MI;Su H;Wang X
在模式生物中进行的遗传筛选有助于确定RNA干扰（RNAi）途径的关键组成部分。隐性遗传筛选最近已成为可行的，通过使用小鼠胚胎干细胞（ES）是布卢姆氏综合征蛋白（Blm）缺陷。在这里，我们开发并进行了隐性遗传筛选，以确定在Blm缺陷的ES细胞中哺乳动物RNAi途径的组成部分。使用逆转录病毒基因陷阱策略的全基因组诱变导致推定的纯合RNAi突变体细胞的分离。候选克隆通过独立的基于RNAi的报告基因测定法确认，并使用分子技术鉴定致病基因陷阱整合位点。我们的筛选鉴定了Argonaute 2（Ago2）的多个突变细胞系，Argonaute 2是RNAi途径的已知必需组分。该结果表明，通过该筛选策略可以分离真正的RNAi组分。此外，Ago2纯合突变ES细胞提供了一个空的遗传背景，进行Ago2蛋白的突变分析。使用基因救援，我们解决了一个重要的争议，两个苯丙氨酸残基的Ago2活性的作用。
Genetic screens performed in model organisms have helped identify key components of the RNA interference (RNAi) pathway. Recessive genetic screens have recently become feasible through the use of mouse embryonic stem (ES) cells that are Bloom's syndrome protein (Blm) deficient. Here, we developed and performed a recessive genetic screen to identify components of the mammalian RNAi pathway in Blm-deficient ES cells. Genome-wide mutagenesis using a retroviral gene trap strategy resulted in the isolation of putative homozygous RNAi mutant cells. Candidate clones were confirmed by an independent RNAi-based reporter assay and the causative gene trap integration site was identified using molecular techniques. Our screen identified multiple mutant cell lines of Argonaute 2 (Ago2), a known essential component of the RNAi pathway. This result demonstrates that true RNAi components can be isolated by this screening strategy. Furthermore, Ago2 homozygous mutant ES cells provide a null genetic background to perform mutational analyses of the Ago2 protein. Using genetic rescue, we resolve an important controversy regarding the role of two phenylalanine residues in Ago2 activity.
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