Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.
Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.
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使用CRISPR-Sprygests精确的DNA裂解。
DOI：
10.1038/s41587-022-01492-y
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发表时间：
2023-03
影响因子：
46.9
通讯作者：
Kleinstiver, Benjamin P.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Christie, Kathleen A.;Guo, Jimmy A.;Silverstein, Rachel A.;Doll, Roman M.;Mabuchi, Megumu;Stutzman, Hannah E.;Lin, Jiecong;Ma, Linyuan;Walton, Russell T.;Pinello, Luca;Robb, G. Brett;Kleinstiver, Benjamin P.
用于体外DNA切割和分子克隆的方法仍然不能精确地切割与感兴趣的碱基直接相邻的DNA。限制性酶（RE）必须结合特定的基序，而野生型CRISPR-Cas9或-Cas 12核酸酶需要原型间隔子邻近基序（PAM）。在这里，我们探索了我们以前报道的近PAM无SpCas 9变体（命名为SpRY）的实用性，以作为各种克隆应用的通用DNA切割工具。通过使用超过130种gRNA对多种PAM进行SpRY DNA切割（SpRYgests），我们发现SpRY在体外是无PAM的，并且可以在几乎任何序列处切割DNA，包括用野生型SpCas 9难以切割的位点。我们说明了SpRYgests在提高几种克隆工作流程的精确度方面的多功能性和有效性，包括RE或经典CRISPR核酸酶无法实现的那些工作流程。我们还优化了快速简单的一锅法gRNA合成方案，以简化SpRYgest的实施。总之，SpRYgests可以改善各种受益于精确DNA断裂的DNA工程应用。无PAM CRISPR核酸酶用于精确的DNA切割和克隆。
Methods for in vitro DNA cleavage and molecular cloning remain unable to precisely cleave DNA directly adjacent to bases of interest. Restriction enzymes (REs) must bind specific motifs, whereas wild-type CRISPR-Cas9 or -Cas12 nucleases require protospacer-adjacent motifs (PAMs). Here we explore the utility of our previously reported near-PAMless SpCas9 variant, named SpRY, to serve as a universal DNA cleavage tool for various cloning applications. By performing SpRY DNA digests (SpRYgests) using more than 130 gRNAs sampling a wide diversity of PAMs, we discover that SpRY is PAMless in vitro and can cleave DNA at practically any sequence, including sites refractory to cleavage with wild-type SpCas9. We illustrate the versatility and effectiveness of SpRYgests to improve the precision of several cloning workflows, including those not possible with REs or canonical CRISPR nucleases. We also optimize a rapid and simple one-pot gRNA synthesis protocol to streamline SpRYgest implementation. Together, SpRYgests can improve various DNA engineering applications that benefit from precise DNA breaks. A PAMless CRISPR nuclease is applied for precision DNA cleavage and cloning.
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