Analysis of Protein-Nucleic Acid Interactions Using Phosphor Imaging Technology
利用荧光成像技术分析蛋白质-核酸相互作用
基本信息
- 批准号:9318111
- 负责人:
- 金额:$ 6.86万
- 依托单位:
- 依托单位国家:美国
- 项目类别:Standard Grant
- 财政年份:1994
- 资助国家:美国
- 起止时间:1994-05-01 至 1996-04-30
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
9318111 Ares Nucleic acid-protein interactions are critical to the correct expression and retrieval of genetic information. Selective transcription of genes requires selective interactions between protein and DNA. Construction of a messenger RNA containing the protein coding information of eukaryotic genes requires the recognition and removal of introns and RNA splicing, a process dependent on an elaborate set of RNA-RNA and RNA-protein interactions. The translation of messenger RNA into protein is carried out by a machinery made of RNA and protein as well, requiring another elaborate set of RNA-RNA and RNA-protein interactions. Control of the level of mRNA is a means by which the expression of genes is regulated, often governed by RNA structural elements in the mRNA. Detailed knowledge of how and when these DNA-protein, RNA-protein, and RNA-RNA interactions are established, maintained and disolved will be essential for understanding the expression of genetic information. A set of powerful "footprinting" or "structure probing" techniques for measuring the environments of nucleotides along a nucleic acid chain is well developed and is in general use among students of nucleic acid structure and function. These approaches rely on detecting differences in accessibility of the nucleic acid under study to some probe (a chemical or nuclease), capable of reacting with nucleic acid. The positions of reaction are mapped on the chain using a variety of techniques, all of which require radioactive labeling of the chain either directly or indirectly. The radioactive products are separated by size on a gel and the sites of reaction are calculated from the size of radioactive products. The amount of reaction at a particular site can be determined by the amout of radioactive material present in products of a particular size. For example, a protein that binds to a specific site on a nucleic acid chain will protect the chain from attack by the probe. After separation and com parison of bound andunbound nucleic acid, gel bands representing protected sites will contain less label. The technical limitations of this general approach are two fold. First, it is often difficult to isolate sufficient amounts of functionally relevant protein-nucleic acid complexes to obtain detectable signals, and second, some interactions are sufficiently subtle that protection from probes, though meaningful, may be only partial, and require careful quantitation of signal. Both of these limitations arise from a single cause: the requirement for exposure of radioactive gels to photographic film for detection and quantitation of radioactive signal. These limitations can be skirted by the use of a new technology, storage phosphor imaging, rather than autoradiography. Phosphor imaging involves exposure of the footprinting gel to a special storage phosphor screen, on which a compound sensitive to radiation is bound. The compound is converted by absorption of a radioactive particle. The screen is then inserted into a laser scanning device that determines the amount of converted compound present at every coordinate on the screen. This data is used to build a computer file that expresses the amount of radiactive material at each position as an image using a grey scale or color. The investigator can inspect the image on a monitor and with the image analysis software, analyze the data quantitatively. This technique is orders of magnitude more sensitive than autoradiography allowing better detection of signal, and unlike photographic film the response of the phosphor to radiation is linear, allowing accurate quantitation. This proposal aims for a material extension of our understanding of the function of nucleic acid-protein complexes and RNA-RNA interactions through the analysis of available footprinting data by the purchase and use of phosphor imaging technology. The Noller and Puglisi groups will use the device in their studies of ribosome structure and func tion in the process of translation. The Ares group will use it in their studies of the role of small nuclear RNAs in spliceosome assembly and pre-messenger RNA splicing. The Peck group will require this technology for understanding the assembly and function of RNA polymerase 111 transcription complexes, and the Silverthorne group will use it to study the role of mRNA structure in the regulation of mRNA stability.
9318111阿瑞斯核酸与蛋白质的相互作用对于正确表达和检索遗传信息至关重要。基因的选择性转录需要蛋白质和DNA之间的选择性相互作用。构建包含真核基因蛋白质编码信息的信使RNA需要识别和去除内含子以及RNA剪接,这一过程依赖于一系列精心设计的RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用。信使RNA到蛋白质的翻译也是由RNA和蛋白质组成的机器完成的,这需要另一套精心设计的RNA-RNA和RNA-蛋白质相互作用。控制信使核糖核酸水平是调节基因表达的一种手段,通常由信使核糖核酸中的RNA结构元件控制。详细了解这些DNA-蛋白质、RNA-蛋白质和RNA-RNA相互作用是如何以及何时建立、维持和消除的,这对于理解遗传信息的表达是必不可少的。一套强大的“足迹”或“结构探测”技术,用于测量核酸链上核苷酸的环境,已经得到了很好的发展,并在核酸结构和功能的学生中普遍使用。这些方法依赖于检测被研究的核酸对能够与核酸发生反应的某种探针(化学物质或核酸酶)的可及性的差异。使用各种技术将反应的位置映射到链上,所有这些技术都需要直接或间接地对链进行放射性标记。放射性产品在凝胶上按大小分开,根据放射性产品的大小计算反应地点。特定地点的反应量可以由特定尺寸的产品中存在的放射性物质的量来确定。例如,一种与核酸链上特定位置结合的蛋白质将保护该链免受探针的攻击。结合和未结合的核酸分离和比较后,代表受保护部位的凝胶条带将含有较少的标记。这种通用方法的技术限制有两个方面。首先,通常很难分离出足够数量的功能相关的蛋白质-核酸复合体来获得可检测的信号,其次,一些相互作用足够微妙,以至于对探针的保护虽然有意义,但可能只是部分的,需要仔细量化信号。这两个限制都是由一个原因引起的:要求将放射性凝胶暴露在照相胶片中以检测和量化放射性信号。这些限制可以通过使用一种新的技术--存储磷光成像,而不是放射自显影来绕过。荧光粉成像包括将足迹凝胶暴露在一个特殊的存储荧光屏上,在屏幕上结合了一种对辐射敏感的化合物。这种化合物通过吸收放射性粒子而转化。然后将屏幕插入激光扫描设备,该设备确定屏幕上每个坐标上存在的转换化合物的量。这些数据被用来建立一个计算机文件,该文件将每个位置的放射性物质的量表示为使用灰度或颜色的图像。调查人员可以检查监视器上的图像,并使用图像分析软件对数据进行量化分析。这种技术比放射自显影灵敏几个数量级,可以更好地检测信号,而且与照相胶片不同,荧光粉对辐射的反应是线性的,可以进行准确的定量。这项建议旨在通过分析现有的足迹数据,通过购买和使用荧光粉成像技术,实质性地扩展我们对核酸-蛋白质复合体的功能和RNA-RNA相互作用的理解。Noller和Puglisi团队将使用该设备研究核糖体结构和翻译过程中的功能。阿瑞斯团队将用它来研究小核糖核酸在剪接体组装和前信使核糖核酸剪接中的作用。Peck小组将需要这项技术来了解RNA聚合酶111转录复合体的组装和功能,Silverthorne小组将使用它来研究mRNA结构在调节mRNA稳定性中的作用。
项目成果
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