Functional annotation of uncharacterized two-substrate enzymes

点击翻译按钮获取中文摘要

Die in den letzten Jahren massenhaft durchgeführte Sequenzierung mikrobieller Genome führte zur Identifizierung zahlreicher unbekannter Gene. Die Funktionsaufklärung der von diesen Genen kodierten Proteine ist eine schwierige und zugleich wichtige Herausforderung der molekularen Biologie. Insbesondere die Entdeckung neuer Enzyme verspricht Einblicke in bisher unbekannte Bereiche des zellulären Metabolismus und in die molekulare Evolution von Proteinen. Wir möchten dieses Problem mit einem neuartigen Ansatz angehen, in dem wir uns auf Enzyme konzentrieren, die zwei Substrate – ein bekanntes und ein unbekanntes – umsetzen. Dazu werden wir das bekannte Substrat radioaktiv markieren und zusammen mit dem rekombinant hergestellten Enzym unbekannter Funktion in einem proteinfreien Zellextrakt inkubieren, der das unbekannte Substrat bereitstellt. Nach dem Umsatz der beiden Substrate durch das Enzym wird das Produkt mit Hilfe seiner Markierung über HPLC aus dem Zellextrakt gereinigt und anschließend mittels Massenspektrometrie und NMR identifiziert. In Vorarbeiten konnten wir die Durchführbarkeit dieses Ansatzes anhand eines Enzyms bekannter Funktion zeigen und wollen ihn nun auf zwei Enzyme (PcrB und TrpB2o) anwenden, die in Struktur und Sequenz Ähnlichkeiten zu zwei von uns charakterisierten Enzymen aus der Biosynthese von Histidin und Tryptophan (HisF und TrpB1) haben, aber andere und bisher unbekannte Funktionen ausüben. Diese Untersuchungen werden ergänzt durch die Analyse von knock-out Stämmen, in denen die pcrB- bzw. trpB2o- Gene deletiert wurden und deren Wachstumsverhalten weitere Einsichten in die Funktion dieser beiden Enzyme verspricht.