Functional annotation of uncharacterized two-substrate enzymes

在最近几年中，通过对基因组进行微生物学测序来鉴定未知基因。Die Funktionsaufklärung der von diesen kodierten Proteine ist eine schwierige und zugleich wichtige Herausforderung der molekularen Biologie.在蛋白质的代谢和分子进化中，新的酶被认为是一种独特的酶。我们需要解决一个新的问题，在我们的酶中，有两种底物-一种是已知的，另一种是未知的。韦尔登将使底物具有放射性标记，并在蛋白质感染的Zellextrakt中使用不适合底物的功能。酶法底物测定后，用高效液相色谱法（HPLC）测定产物，用质谱法和核磁共振法进行鉴定。在前面的研究中，我们可以将酶的功能分为两个部分，分别是组氨酸和色氨酸的生物合成酶（HisF和TrpB 1）的结构和序列，但这些酶的功能并不完全相同。这些韦尔登是通过对淘汰赛的分析得出的。trpB 2 o-基因的缺失会使酶的功能受到影响。

Die in den letzten Jahren massenhaft durchgeführte Sequenzierung mikrobieller Genome führte zur Identifizierung zahlreicher unbekannter Gene. Die Funktionsaufklärung der von diesen Genen kodierten Proteine ist eine schwierige und zugleich wichtige Herausforderung der molekularen Biologie. Insbesondere die Entdeckung neuer Enzyme verspricht Einblicke in bisher unbekannte Bereiche des zellulären Metabolismus und in die molekulare Evolution von Proteinen. Wir möchten dieses Problem mit einem neuartigen Ansatz angehen, in dem wir uns auf Enzyme konzentrieren, die zwei Substrate – ein bekanntes und ein unbekanntes – umsetzen. Dazu werden wir das bekannte Substrat radioaktiv markieren und zusammen mit dem rekombinant hergestellten Enzym unbekannter Funktion in einem proteinfreien Zellextrakt inkubieren, der das unbekannte Substrat bereitstellt. Nach dem Umsatz der beiden Substrate durch das Enzym wird das Produkt mit Hilfe seiner Markierung über HPLC aus dem Zellextrakt gereinigt und anschließend mittels Massenspektrometrie und NMR identifiziert. In Vorarbeiten konnten wir die Durchführbarkeit dieses Ansatzes anhand eines Enzyms bekannter Funktion zeigen und wollen ihn nun auf zwei Enzyme (PcrB und TrpB2o) anwenden, die in Struktur und Sequenz Ähnlichkeiten zu zwei von uns charakterisierten Enzymen aus der Biosynthese von Histidin und Tryptophan (HisF und TrpB1) haben, aber andere und bisher unbekannte Funktionen ausüben. Diese Untersuchungen werden ergänzt durch die Analyse von knock-out Stämmen, in denen die pcrB- bzw. trpB2o- Gene deletiert wurden und deren Wachstumsverhalten weitere Einsichten in die Funktion dieser beiden Enzyme verspricht.