Sorting of yeast late endosomal SNAREs and assembly of this SNARE complex

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Die molekularen Mechanismen des Membrantransports sind in allen Eukaryotenzellen evolutionär konserviert, so dass Hefe ein ideales Modellsystem zur Untersuchung dieser Prozesse darstellt. Während der Bildung von Transportvesikeln werden diese mit spezifischen Proteinen beladen. Erkennung zwischen Transportvesikel und Zielmembran erfordert spezifische Rab GTPase und tether Proteine. Membranfusion wird durch SNAREs vermittelt, die untereinander über SNARE-Motive Komplexe bilden. Endosomale und lysosomale Transportwege spielen eine wichtige Rolle im Abbau und in der Regulation der Signaltransduktion. In diesem Antrag planen wir, die Ausbildung des späten endosomalen SNAREKomplexes der Hefe, der aus Pep12p, Vti1p, Syn8p und Ykt6p besteht, sowie Komplexe mit akzessorischen Proteinen zu untersuchen. Zusätzlich zu Koimmunopräzipitationen soll ein FRET-Assay entwickelt werden, um die Assemblierung und Dissoziation des SNARE Komplexes in lebenden Zellen mittels ts-Mutanten zu untersuchen. Anschließend sollen Komplexe dieser SNAREs mit dem tether-Protein Vac1p und Vps33p, einem Mitglied der regulatorischen SMProteinfamilie charakterisiert werden. Das vti1-3 Allel mit zwei Aminosäureänderungen in der N-terminalen Domäne von Vti1p soll benutzt werden, um die Funktion dieser Domäne zu untersuchen und weitere Interaktionspartner zu identifizieren. Wir planen, unsere Studien zur Rolle des ENTH-Proteins Ent3p in der Sortierung von Vti1p, Pep12p und Syn8p zu erweitern. Phosphorylierungsstellen in Ent3p sollen identifiziert und ihre Funktion bestimmt werden. Scy1p soll untersucht werden, da das verwandte Säugerprotein CVAK104 das zu Ent3p orthologe EpsinR bindet und SNAREs sortiert, die mit Vti1p und Syn8p verwandt sind.