How Ubiquitylation Coordinates Cell Division and Differentiation - Function and Regulation of E3 Ubiquitin Ligases Beyond the Cell Cycle

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Voraussetzung für die Entwicklung von mehrzelligen Organismen ist die enge Koordination zwischen Proliferation und Differenzierung. Ob Zellen sich kontinuierlich teilen oder den Zellzyklus vorüberge-hend bzw. permanent verlassen, hängt wesentlich von der Aktivität der E3 Ubiquitin Ligasen ab, die den Verlauf des Zellzyklus koordinieren. E3 Ligasen sind Enzyme, die ihre Substrate durch die kova-lente Bindung von Ubiquitinmolekülen modifizieren. Die Modifikation mit mehreren Ubiquitinmolekülen kann dazu führen, dass das Substrat vom 26S Proteasom erkannt und abgebaut wird. Eine der wich-tigsten E3 Ligasen die den Zellzyklus koordinieren ist der Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C). Bisher ist der APC/C vor allem aufgrund seiner essenziellen Funktionen in der Mitose unter-sucht worden. In letzter Zeit deuten allerdings mehrere Studien daraufhin, dass E3 Ligasen, unteran-derem der APC/C, weitere zusätzliche Funktionen während der sogenannten Ruhephase (G0-Phase) und der Zelldifferenzierung haben, wie z.B. der Neurogenese und der Muskeldifferenzierung (Myoge-nese). Diese unerwarteten Funktionen wichtiger Zellzyklusproteinen sind weitgehend unerforscht und es ist daher unklar wie die Aktivität und die Spezifizität der E3 Ligasen außerhalb des Zellzyklus regu-liert wird.In meinen Vorarbeiten habe ich eine Methode entwickelt, die es erlaubt den APC/C und seine Binde-partner, aus definierten Phasen des Zellzyklus aufzureinigen und durch quantitative Massenspektro-skopie zu vergleichen. Mit Hilfe dieser Methode soll untersucht werden, wie die Aktivität und die Spe-zifizität des APC/C während des Übergangs in die G0-Phase, bzw. während der zellulären Differenzie-rung, reguliert wird. Zur funktionellen Charakterisierung identifizierter APC/C Bindepartner und zur Bestimmung der Aktivität des APC/C in lebenden Zellen haben wir eine „Gen-Targeting“ Methode entwickelt, die es erlaubt in kurzer Zeit die Gene von fluoreszierenden Proteinen direkt in die endoge-nen Loci von Kandidaten zu integrieren. Dadurch wird eine mögliche falsche Bewertung nachfolgender Analysen aufgrund von Überexpression vermieden. Um die zugrunde liegenden molekularen Me-chanismen aufzudecken, die für die Regulation des APC/C verantwortlich sind, werden wir auf in vitro Ubiquitylierungsexperimente zurückgreifen, die auf gereinigten Proteinen basieren.Um die Rolle der E3 Ligasen während zellulärer Differenzierung zu verstehen, ist es unerlässlich zuerst ihre relevanten Substrate zu identifizieren. Daher werden wir anhand der Myogenese untersuchen, wie Ubiquitylierung durch den APC/C und durch weitere E3 Ubiquitin Ligasen, wie z.B. SCF(MAFbx), die Differenzierung von Myoblasten in funktionelle Muskelzellen (Myotubes) koordiniert. Mit Hilfe einer vom mir entwickelten Methode, die es erlauben wird sowohl das Substrat als auch die modifizierte Aminosäure in einem einzigem Experiment festzustellen, sollen die Substrate spezifischer E3 Ligasen in definierten Abschnitten der Myogenese im globalen Maßstab identifizieren werden. Ziel des Antrags ist ein detailliertes Verständnis der Regulation von E3 Ligasen während des Übergangs zwischen Proliferation und Differenzierung zu gewinnen und somit zur Entwicklung möglicher Therapien gegen Krebs und Muskelatrophie beizutragen.