(i) Identification of single-molecule protein complexes involved in cellular transport of prosthetic groups (Moco and heme) (ii) Generation of monoclonal antibodies directed against protein motifs involved in binding prosthetic groups

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Protein-Protein Interaktionen und Co-Faktor Transport sind zentrale Themen von PROTRAIN. In diesem Projekt werden wir einen “Einzelmolekül-Pull-down Assay“ für Mocound Häm-Proteine entwickeln, um Antigene in einzelnen Komplexen direkt aus dem Zelllysat zu analysieren. Der Assay wird Kandidatenproteine in verschiedenen Antikörper-Antigen Komplexen identifizieren und die Komplexe charakterisieren, beim Transport der prosthetischen Gruppen sowie im zellulären Zusammenhang. Die neue Fähigkeit, direkt stöchiometrische Informationen unter nahezu physiologischen Bedingungen zu erhalten, wird dazu benutzt, Interaktionen von Moco-Synthese- und Insertionsproteinen sowie von Häm d1 und Häm-Kofaktor Proteinen zu entschlüsseln. Da die Technik von der Verfügbarkeit geeigneter Antikörper abhängt, werden wir das Antibody-Facility-Projekt aus der ersten Antragsperiode inkorporieren und weiter ausbauen. Dieses Projekt generierte Antikörper gegen gereinigte rekombinante Proteine, Proteindomänen oder Protein-Tags, wie sie von den PROTRAIN Kooperationspartnern geliefert wurden. Die erhaltenen Antikörper hatten die gewünschte Spezifität und Reaktivität und wurden so zu integralen Bestandteilen von PROTRAIN Publikationen. Auf diese positiven Resultate aufbauend, werden weitere Antikörper mit einem besonderen Augenmerk auf konformationsspezifische Antikörper generiert, für dieses und andere PROTRAIN-Projekte.