Development of tooth regenerative technology based on the spatiotemporal transcriptome analysis and iPS interference

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本申請研究では，「臓器としての歯の再生」を最終目的に，1細胞レベルでのRNA発現解析(single cell RNA-Seq)に加えて，時空間情報を加味 した遺伝子発現解析法(spatial RNA-Seq)を駆使し，歯胚発生における1細胞レベル時空間的トランスクリプトームMapを構築する．そして，これらのデータベースをもとに，iPS干渉法を用いて上皮陥入部位の歯原性上皮・間葉細胞を特徴付けているマスター転写因子を信頼性高く同定し，真に上皮間葉相互作用を引き起こす能力がある歯原性上皮・間葉細胞の誘導方法を開発する事を目的としている．2022年度は，2021年度に引き続き，歯胚発生における1細胞レベル時空間特異的トランスクリプトームMapの構築を試みた.具体的には，マウスE10.5，E11 .5，E12.5 ，E14.5，E18.5の歯胚を摘出し，酵素処理にて約1万細胞の単一細胞を得て，Single cell RNA-Seq (scRNA-Seq)解析を行った．また，メッシュ状に位置情報となるインデックス配列が付加されたスライドガラスに，E10.5，E11.5，E12.5，E14.5，E16.5の歯胚を含むマウス頭部前頭断の凍結切片を貼り付け，HE染色を行い，組織学的情報を取得した．そして，スライド上でmRNAを単離，位置情報のインデックス配列が付加されたcDNAを合成し，ライブラリー作製後にシークエンスを行った.またシークエンスデータのインデックス情報から，二次元空間での遺伝子発現情報を構築し，遺伝子発現Mapを構築した (Spatial RNA-seq).そして，scRNA-seqのデータとSpatial RNA-seqのデータを統合し，1細胞レベル時空間的トランスクリプトーム解析を行った．