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Creation of artificial genetic system with acyclic artificial nucleic acids and application to evolutionary molecular engineering

无环人工核酸人工遗传系统的构建及其在进化分子工程中的应用

基本信息

批准号：
21H05025
负责人：
浅沼浩之
金额：
$ 121.89万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-05 至 2026-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21H05025/
关键词：
人工核酸 Pre-RNA world 化学ライゲーション SNA L-aTNA

项目摘要

L-aTNAの複製と同様にL-aTNAのランダム配列プールを使用して、17-merの鋳型DNA鎖およびRNA鎖のL-aTNA鎖への逆転写を検討した。DNAを鋳型鎖に用いた場合は、L-aTNA 4 merのランダム配列プールを用い16 merのDNA鋳型鎖と8 merのL-aTNAプライマーで逆転写を実現した。一方RNAを鋳型に用いた場合は、L-aTNAの複製と同じ3-merのランダム配列プールでL-aTNAへの逆転写を実現した。DNAを鋳型鎖に用いてDNA鎖の非酵素的ライゲーションを検討した結果、Mn2+よりCd2+, Co2+, Ni2+など、イミダゾールと強く相互作用する金属イオンの方がライゲーション活性の向上が顕著であった。Cd2+で最適化したところ、酵素（リガーゼ）に匹敵する活性が得られた。さらに反応速度論解析から、CNImによるリン酸の活性化が律速段階であることが判明した。その解析を基にL-aTNA鎖のプライマー伸長反応を再検討し、伸長方向をこれまでの逆の1’→3‘にしてCd2+を使用することで、29merのL-aTNA鋳型鎖を4℃4時間で80%以上の収率で得られた。前年度配列既知の10 merのSNAに対して相補配列を持つDNAを、そのランダムプールから釣り上げられることを示した。そこで更に長い20 merのSNAを釣り上げる方法を検討した。その結果、中央に配列既知の2 merを挿入してランダマイズしたDNA 10merを使用すれば、20 merのSNAに対して10 merずつ分割して相補的なDNAが釣れることが判った。前年度開始する予定だったL-aTNA鎖のサーマルサイクルによる自己複製を検討した。まずは16 merのL-aTNA鋳型鎖に相補的な2つの8 merのL-aTNAフラグメントの連結反応がサーマルサイクルで自己増幅可能か検討した。鋳型鎖に対してプライマーとフラグメント鎖を過剰に加え、連結反応（2h, 25℃）→加熱（94℃）→急冷(0℃)というサイクルを回したところ、サイクル毎に連結産物の増加が観察され、4サイクル後は鋳型鎖に対して150%の収率で連結産物が得られた。

L-aTNA replication and the same L-aTNA sequence are discussed in this paper. 17-mer DNA locks and RNA locks are also discussed. In the case of DNA type lock, the L-aTNA 4-mer DNA type lock and the L-aTNA 8-mer DNA type lock are reversed. In the case of RNA replication, 3-mer replication and reverse transcription of L-aTNA can be achieved. The results of non-enzymatic reaction of DNA type locks with Mn2 +, Cd2 +, Co2+, Ni2 + and strong interaction between metals and enzymes show that the activity of DNA type locks increases. Cd2 + is optimized for enzyme activity. The analysis of the inverse velocity theory, CNIm, and the activation of the acid, the order of the velocity, is clear. L-aTNA locks with 29-mer L-aTNA locks have a recovery rate of more than 80% at 4℃ for 4 hours. The previous year's arrangement of the 10-mer SNA was complementary to the previous year's arrangement of the DNA, and the previous year's SNA was complementary to the previous year's arrangement of the DNA. The 20 mer SNA is a new method of searching. As a result, the central alignment of known 2-mer DNA fragments into the 10-mer DNA fragment is used, and the 20-mer SNA fragment into the 10-mer DNA fragment is used. The previous year began with a scheduled L-aTNA lock. The 16-mer L-aTNA type lock is complementary to the 2-mer L-aTNA type lock and the link is reversed. The temperature of the lock is increased, and the link is reversed (2h, 25℃) → heated (94℃) → quenched (0℃) → the link product is increased, and the link product is obtained at a rate of 150%.