Development of a novel in vitro skin sensitization assay with predictive ability comparable to animal studies

开发一种新型体外皮肤致敏测定方法，其预测能力可与动物研究相媲美

• 批准号: 21K02070
• 负责人: 黒瀬 光一
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Tokyo University of Marine Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K02070/
• 关键词: 代替法試験; 免疫原性試験; アレルギー

我々が開発したRPB-h-CLAT法において、これまで24時間を要した被験物質の曝露時間を5時間に短縮することを試みた。THP-1細胞に代表的な感作性物質と非感作性物質を曝露し、total RNAを抽出した後、mRNA-seq解析に供した。感作性物質に対し特異的に発現変動した12遺伝子を選別し、Real-time RT-PCR解析を行った。その中からmRNA-Seq解析結果と整合性のみられた5遺伝子をマーカー候補として選択した。次いで、別の感作性物質7種と非感作性物質2種を用いて5時間曝露における候補マーカー評価をReal-time RT-PCR解析により行った。以上により、曝露時間短縮によっても感作性を正しく評価可能なマーカー候補遺伝子と評価基準を検討した。その結果、曝露時間を5時間に短縮した場合においても、RPB-h-CLAT法による感作性評価が可能であることが示された。一方、化学物質の代謝活性化による感作性を検出可能にするために、代謝活性化に関わるcytochrome P450（CYP）分子種とP450 oxidoreductase (POR)とを安定的に共発現するTHP-1細胞株の樹立をめざし、昨年実施したCYP1A1とPORに加えて今年度はCYP2E1とCYP3A5のcDNAを、Episomal発現 Vector であるpEBMulti-Neoにそれぞれサブクローニングした。なお、cDNA塩基配列を調べた上で、活性低下をきたす変異をSite Directed Mutagenesis法により取り除いた。次いで、遺伝子導入の困難なTHP-1細胞での安定発現株を樹立するために黄色蛍光タンパクeYFPをpEBMulti-Hygにサブクローニングし、蛍光顕微鏡でモニタリングしながらトランスフェクション効率を最適化し、PORとCYP3A5の遺伝子導入に成功した。

We use the RPB-h-CLAT method to test the exposure time for 24 hours and the exposure time for 5 hours for short periods of time. The sensory substance represented by THP-1 cell, the non-sensory substance, the exposure, the total RNA extract, the mRNA-seq analysis. The realization of the characteristics of the perceptual property. Select a different file and Real-time RT-PCR parsing line. The results of the analysis of the mRNA-Seq in the database show that you have selected a candidate for the first half of the year. The second and the third part of the article, 7% of the non-sensitive substance, 2% of the non-sensitive substance, the second time of exposure, the second time exposure, the second, the second, the second The above exposure time is short, and the sexual response is correct. It is possible that the basic level of health care may be affected. The results of the test, the exposure time of 5 minutes, and the sensitivity of the RPB-h-CLAT method may affect the results of the test. On the one hand, the chemical compound makes it possible to activate cytochrome P450 (CYP) molecules such as P450 oxidoreductase (POR), stable THP-1 cell lines, last year's CYP1A1 POR, and this year's CYP2E1 CYP3A5 cDNA, Episomal's Vector CYP3A5 cDNA, and Episomal to activate Vector P450 (POR) molecules. On the basis of cDNA, there is a column of low activity and low activity. The Site Directed Mutagenesis method is used to get rid of the drug. In the second place, the THP-1 cell is stable, the current plant is stable, the yellow light is yellow, the eYFP is pEBMulti-Hyg, the yellow is yellow, the light is small, and the rate is the most stable, and the POR CYP3A5 is the most effective.