Development of a novel in vitro skin sensitization assay with predictive ability comparable to animal studies

我々が開発したRPB-h-CLAT法において、これまで24時間を要した被験物質の曝露時間を5時間に短縮することを試みた。THP-1細胞に代表的な感作性物質と非感作性物質を曝露し、total RNAを抽出した後、mRNA-seq解析に供した。感作性物質に対し特異的に発現変動した12遺伝子を選別し、Real-time RT-PCR解析を行った。その中からmRNA-Seq解析結果と整合性のみられた5遺伝子をマーカー候補として選択した。次いで、別の感作性物質7種と非感作性物質2種を用いて5時間曝露における候補マーカー評価をReal-time RT-PCR解析により行った。以上により、曝露時間短縮によっても感作性を正しく評価可能なマーカー候補遺伝子と評価基準を検討した。その結果、曝露時間を5時間に短縮した場合においても、RPB-h-CLAT法による感作性評価が可能であることが示された。一方、化学物質の代謝活性化による感作性を検出可能にするために、代謝活性化に関わるcytochrome P450（CYP）分子種とP450 oxidoreductase (POR)とを安定的に共発現するTHP-1細胞株の樹立をめざし、昨年実施したCYP1A1とPORに加えて今年度はCYP2E1とCYP3A5のcDNAを、Episomal発現 Vector であるpEBMulti-Neoにそれぞれサブクローニングした。なお、cDNA塩基配列を調べた上で、活性低下をきたす変異をSite Directed Mutagenesis法により取り除いた。次いで、遺伝子導入の困難なTHP-1細胞での安定発現株を樹立するために黄色蛍光タンパクeYFPをpEBMulti-Hygにサブクローニングし、蛍光顕微鏡でモニタリングしながらトランスフェクション効率を最適化し、PORとCYP3A5の遺伝子導入に成功した。

我々が開発したRPB-h-CLAT法において、これまで24時間を要した被験物質の曝露時間を5時間に短縮することを試みた。THP-1細胞に代表的な感作性物質と非感作性物質を曝露し、total RNAを抽出した後、mRNA-seq解析に供した。感作性物質に対し特異的に発現変動した12遺伝子を選別し、Real-time RT-PCR解析を行った。その中からmRNA-Seq解析結果と整合性のみられた5遺伝子をマーカー候補として選択した。次いで、別の感作性物質7種と非感作性物質2種を用いて5時間曝露における候補マーカー評価をReal-time RT-PCR解析により行った。以上により、曝露時間短縮によっても感作性を正しく評価可能なマーカー候補遺伝子と評価基準を検討した。その結果、曝露時間を5時間に短縮した場合においても、RPB-h-CLAT法による感作性評価が可能であることが示された。一方、化学物質の代謝活性化による感作性を検出可能にするために、代謝活性化に関わるcytochrome P450（CYP）分子種とP450 oxidoreductase (POR)とを安定的に共発現するTHP-1細胞株の樹立をめざし、昨年実施したCYP1A1とPORに加えて今年度はCYP2E1とCYP3A5のcDNAを、Episomal発現 Vector であるpEBMulti-Neoにそれぞれサブクローニングした。なお、cDNA塩基配列を調べた上で、活性低下をきたす変異をSite Directed Mutagenesis法により取り除いた。次いで、遺伝子導入の困難なTHP-1細胞での安定発現株を樹立するために黄色蛍光タンパクeYFPをpEBMulti-Hygにサブクローニングし、蛍光顕微鏡でモニタリングしながらトランスフェクション効率を最適化し、PORとCYP3A5の遺伝子導入に成功した。