高速AFM/光ピンセット複合機を用いたSMCの液-液相分離の形成・破壊機構の解明

コヒーシンやコンデンシンに代表される環状のモータータンパク質であるSMCは染色体の形成過程において重要な役目を担うが、その分子レベルの原理に関して不明な点が多い。そのため、高速AFMを用いて、サブ分子レベルでの現象を可視化し、原理解明を行うことを目的として研究を行っている。蛍光顕微鏡を用いた先行研究例では、DNAが宙に浮いた状態で実験を行うため、トポロジカル結合した分子の動きを可視化できるのに対し、高速AFMでは分子を基板に吸着させる必要があるため、うまくダイナミクスを可視化できない問題があった。この問題を克服するために、前年度の研究において、非特異吸着を防ぐことが可能な脂質膜を用いることで吸着力を抑制し、分子のダイナミクスを可視化することに成功した。しかし、吸着力を弱くした状態ではダイナミクスは見えるものの分子の構造が観察できないため、吸着力を強くすると分子が壊れてしまうという問題があった。2022年度において、脂質膜の組成と観察用のバッファー条件、分子のローディング条件などを最適化することで、DNAにSMCが結合した状態であっても長時間に渡って安定してサブ分子分解能イメージング可能な条件を見つけることに成功した。更に、SMCがDNAをトポロジカル結合するメカニズムとして、ヘッドから入る説とヒンジから入る説が未だに存在し、決着が付いていない状態にある。これを明らかにするために、ワイルドタイプと、加水分解を抑制したATPaseミュータントの実験結果を比較した実験を行い、SMCがDNAをエンブレースする真の描像を明らかにすることに成功した。

コヒーシンやコンデンシンに代表される環状のモータータンパク質であるSMCは染色体の形成過程において重要な役目を担うが、その分子レベルの原理に関して不明な点が多い。そのため、高速AFMを用いて、サブ分子レベルでの現象を可視化し、原理解明を行うことを目的として研究を行っている。蛍光顕微鏡を用いた先行研究例では、DNAが宙に浮いた状態で実験を行うため、トポロジカル結合した分子の動きを可視化できるのに対し、高速AFMでは分子を基板に吸着させる必要があるため、うまくダイナミクスを可視化できない問題があった。この問題を克服するために、前年度の研究において、非特異吸着を防ぐことが可能な脂質膜を用いることで吸着力を抑制し、分子のダイナミクスを可視化することに成功した。しかし、吸着力を弱くした状態ではダイナミクスは見えるものの分子の構造が観察できないため、吸着力を強くすると分子が壊れてしまうという問題があった。2022年度において、脂質膜の組成と観察用のバッファー条件、分子のローディング条件などを最適化することで、DNAにSMCが結合した状態であっても長時間に渡って安定してサブ分子分解能イメージング可能な条件を見つけることに成功した。更に、SMCがDNAをトポロジカル結合するメカニズムとして、ヘッドから入る説とヒンジから入る説が未だに存在し、決着が付いていない状態にある。これを明らかにするために、ワイルドタイプと、加水分解を抑制したATPaseミュータントの実験結果を比較した実験を行い、SMCがDNAをエンブレースする真の描像を明らかにすることに成功した。