Calorimetric evaluation of the irreversible nucleation process from the reversible oligomers of denatured proteins and its application

点击翻译按钮获取中文摘要

項目(1)では、昨年度に引き続きPDZ3の野生型と、RO状態を不安定化したアミノ酸置換体F340Aとを用いて、DSCにより、降温走査とそれに続く昇温走査のみかけの熱容量の差から、ROから会合核形成への不可逆的反応に伴う熱の測定について、DSCによる詳細な検討を行うとともに、低温ショック蛋白質の変性状態に大きな影響を与えるジスルフィド結合の導入とタンデム化変異体の作成を行った。詳細なDSC測定により、DSC測定中に生じる不可逆的な反応によって、溶液中の平衡反応に関係する蛋白質濃度が減少することにより、みかけの速度論的効果が生じていることが強く示唆された。これは、当初計画していた、DSCによる降温走査とそれに連続する昇温走査を差し引くことによって平衡反応の熱の寄与を打消すことは困難なことを示唆している。このため、平衡反応（可逆反応）と不可逆的反応の両方を明示的に取り入れた新しい解析モデルを開発し、複数の走査速度や蛋白質濃度のデータを用いたグローバル解析が必要なことが明らかになった。令和5年度はこの解析法の実現をめざすこととする。項目(2)では、低温ショック蛋白質で、変性状態の構造に大きな変化を与えるアミノ酸置換体として、既に作成した2本の分子内ジスルフィド結合を導入することで高安定化に成功した変異体に更に3本目のジスルフィド結合を導入し、変性状態での疎水相互作用を強めることを試みたが、RO形成は観測されなかった。また、2本のジスルフィド結合を導入した2分子を短いペプチドで結合させたタンデム化変異体を作成し、エントロピー的にRO形成の促進を試みた。この変異体は溶解度が低下したため、RO形成促進の証拠はまだ得られていないが、タンデム化によって一本鎖DNAへの結合性が100倍以上上昇したことを示す実験データを得ることに成功した。