生細胞内でシャペロン活性を持つ自己集合性化合物の開発

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本研究課題では、変性タンパク質と共集合して小胞体ストレスによる細胞死を抑制する自己集合性化合物であるX441Aを同定し、誘導体の開発と作用メカニズムの解明を進めてきた。昨年度までの研究により、X441Aは正常タンパク質よりも変性タンパク質と共集合体を形成しやすいことが試験管内の実験により解明された。また、X441Aの生細胞における作用は、細胞のオートファジー・リソソーム過程が必要であることも示唆された。本年度は、X441Aの作用機序をさらに詳細に解明するために、X441Aと変性タンパク質が生細胞内で共集合することを実証した。生細胞イメージング実験を行うために、X441Aと緑色蛍光色素とを共有結合させた誘導体であるX441A-Fluを設計、開発した。変性タンパク質はユビキチン化されることが知られていることから、変性タンパク質のマーカーとして赤色蛍光タンパク質mRFPとユビキチンを融合させたmRFP-ubiquitinを用いた。共染色実験の結果、小胞体ストレス誘起剤であるツニカマイシンの存在下において、HEK293細胞の細胞内でX441A-FluとmRFP-ubiquitinの蛍光シグナルが空間的に一致し、これらが共局在している様子が観察された。さらに、青色のリソソームマーカーであるmtagBFP2-lysosome20との共染色実験によって、X441A-FluとmRFP-ubiquitinの共集合体がリソソームに局在していることが観察された。この結果により、X441Aと変性タンパク質の共集合体は、オートファジー・リソソーム過程によって分解されるというこれまでの結果が、生細胞イメージング実験からも支持された。